Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Ответ в SkyGen «предст.»
Правила форума Правила форума: в каталоге включаются фирмы, полезные для био-, хим- или мед-лабораторий;
вносить новые описания могут все участники (и зарегистрированные, и гости);
для того, чтобы внести описание фирмы, не обязательно быть её представителем;
автор описания может удалять ЛЮБЫЕ сообщения в теме — и свои и чужие.
NB! создание описаний - премодерируемое. Они становятся видимыми посетителям только после проверки модератором.

Описания компаний удобнее смотреть здесь (отбор по классификатору, личный фильтр, несколько описаний на страницу).
Вся контактная информация на одной странице: российские компании, зарубежные компании

Подробно о компаниях:
Компания 'Хеликон'  Компания 'Евроген'  Компания 'TPP Techno Plastic Products AG'  Компания 'Миллипор'  Компания 'СтормовЪ'
подробные описания размещаются бесплатно; нужно лишь подготовить читабельный текст

Иконка сообщения*  [ Без иконки ]   Важно!   Вопрос   Информация     Обмен опытом   Шутка, забавная история     Поздравления, благодарности   Возмутительно!   Проблема   Картинки, фотографии
Введите имя

 [вст. закрывающие теги*

*


*



Смайлик: согласен Смайлик: не согласен Смайлик: улыбка Смайлик: пожалуйста, умоляю! Смайлик: помираю со смеху Смайлик: подмигивание Смайлик: подшучивать, дразнить Смайлик: смущение Смайлик: мне стыдно Смайлик: жуть! Смайлик: не понял Смайлик: закатывать глаза Смайлик: недовольство, огорчение Смайлик: рёв в три ручья Смайлик: злость Смайлик: супер Смайлик: умник Смайлик: чайник Смайлик: сходка Смайлик: Ура! Смайлик: не получается!
Перевод выделенного текста из латиницы в кирилицу. Текст в квадратных скобках '[]' не преобразуется

Пример: biologija -> биология [b] - полужирный шрифт

Пример: [b]полужирный[/b] [i] - курсив

Пример: [i]курсив[/i] [u] - подчёркнутый

Пример: [u]подчёркнутый[/u] [sup] - верхний индекс

Пример: температура 37[sup]o[/sup]C [sub] - нижний индекс

Пример: H[sub]2[/sub]O - вода [QUOTE] - применяется для цитирования чужих сообщений, цитата вставляется с небольшим отступом от края текста

Пример: [QUOTE]цитата[/QUOTE] [code] - форматирование как при вводе
Применяется для вывода теста как он есть, с предотвращением форматирования (автопереноса на новую строку), без интерпретации кодов форума и смайликов; вставляется с небольшим отступом от края текста.

Пример: 
[code]
программный код
	1 строка
	2 строка
[/code] [list] - список:
возможны опции: 1, a, A, i, I
[list] неупорядоченный; 
[list=1] нумерованный; 
[list=A] упорядоченный по буквам A-Z

Пример:
[list=1]
[*] первая строка;
[*] вторая строка;
[/list] Тег [hr] - горизонтальная разделительная линия

Пример: 
Абзац 1
[hr]
Абзац 2 [url] - гиперссылка

Примеры:
[url]www.ncbi.nlm.nih.gov[/url]
[url=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/]NCBI[/url] [email] - ссылка на адрес электронной почты

Пример: [email]masha@mail.ru[/email] Тег [img] - рисунок
[img] - в строке;
[imgL] - выравнивание по левому краю; 
[imgR] - выравнивание по правому краю.

Пример:
[img]http://molbiol.ru/izo/rl.gif[/img] [ru] - только для русских читателей

Пример:
[ru]это увидят только те, кто использует русский интерфейс[/ru] [en] - только для английских читателей

Пример:
[en]это увидят только те, кто использует английский интерфейс[/en] [self] - текст виден только вам и администрации

Пример:
[self]это увидите только вы сами[/self]
[left] - выравнивание по левому краю

Пример: [left]текст слева[/left] [center] - выравнивание по центру

Пример: [center]текст в центре[/center] [right] - выравнивание по правому краю

Пример: [right]текст справа[/right] [just] - выравнивание по обоим краям

Пример: [just]выровненный текст[/just]

     размер сообщения / макс. размер:  / 15360


Последние 10 сообщений [ в обратном порядке ]
SkyGen Отправлен 01.06.2015 16:22
  Готовые двуцепочечные гены длиной до 5000 п.о. по доступным ценам от IDT DNA


[attachmentid()=225658]

Данный обзор предназначен для всего широкого числа пользователей, которым для самых разных целей требуются протяженные двуцепопченые фрагменты генов, длиной до 200 до 5000 пар оснований, как в виде фрагментов цепи ДНК, так и в составе плазмиды.
Воспользуйтесь возможностью ускорить свои научные исследования уже сегодня, используя в работе готовые протяженные фрагменты генов, синтезированные с высочайшей точностью, по доступной цене, которые могу быть доставлены из США в течение 2-3 недель.

Научные группы, перед которыми стоят задачи конструирования генов, создания рекомбинантных антител, вакцин, работы с CRISPR-системой редактирования генома, и которым требуются контроли для ПЦР и реал-тайм ПЦР, сегодня могут не тратить время и силы на сшивку длинных фрагментов. Также, возможно избежать трудностей и ошибок при встраивании гена интереса в плазмидный вектор. Следовательно, все время и средства, сэкономленные на осуществление на данных этапов, возможно потратить на решение интересующей научной проблемы.

Данный обзор предназначен для всего широкого числа пользователей, которым необходимы протяженные двуцепопченые фрагменты генов, длиной от 200 до 5000 пар оснований, как в виде фрагментов двухцепочечной ДНК, так и в составе плазмиды.

1. Фрагменты двуцепочечных генов gBlocks<sup>&reg;</sup>

gBlocks - это двуцепочечные фрагменты генов от компании IDT DNA Technologies. В чем преимущество этого продукта по сравнению с другими предложениями на рынке?
Проверенное временем качество IDT DNA, лидера рынка США и мира в области синтеза ДНК и РНК
Сроки поставки из США от 2 до 3 недель, в зависимости от сложности последовательности и длины гена
Подтвержденная секвенированием последовательность генов и высокая точность синтеза
gBlocks могут быть использованы для конструкции и модификации генов, разработки антител и в исследованиях с использованием системы редактирования генома CRISP, а также быть как стандарты для qPCR и для решения многих других задач. некоторые направления возможных приложений таких генов приведены на рисунке 1.

Рисунок 1. Схема возможных направлений применения gBlocks от компании IDT DNA.

[attachmentid()=225657]

Кроме генов с определенной последовательностью, мы предлагаем библиотеки фрагментов двуцепочечных генов gBlocks - это множество генов, у которых консервативные участки перемежаются с участками до 18 последовательных варьирующихся оснований (N или K), такие библиотеки могут использоваться для производства рекомбинантных антител и конструирования белков.

2. Какие форматы синтеза и доставки доступны в компании СкайДжин?
А. Вы можете заказать гены в виде протяженного фрагмента двухцепочечной ДНК - в виде gBlocks, который далее может использоваться для любого метода клонирования, включая сборку по Гибсону, методы клонирования по тупым концам и клонирования с липкими концами. gBlocks могут быть синтезированы с/без фосфатной группой на 5'-конце. Длина таких фрагментов может составлять от 12 до 2000 п.о. Такие гены доставляются в сухом виде, с количеством вещества 200 нг.

Б. Также возможно заказать двухцепочечный ген, клонированный в плазмидный вектор, уже готовый к введению в E.Coli. Такой вариант заказа гена называется Custom gene. Такой вектор может содержать участок устойчивости к ампициллину, канамицину или хлорамфениколу, а также сайты рестрикции на 3'- и 5'-концах. Также, для специальных задач по in vitro транскрипции можно выбрать вектор pIDTBlue для генов с длиной большей, чем 1500 п.о. Гены с длиной более чем 5000 п.о. поставляются в составе плазмид или бактериальных искусственных хромосом (BACs).
Гены, встроенные в плазмиду длиной более 5000 п.о., поставляются в количестве 4 мкг, в сухом виде. Гены длиной менее 5000 п.о., в составе бактериальных искусственных хромосом (BACs), доставляются в сухом виде, в количестве 1 мкг.

3. При выборе синтеза гена в векторе, какие варианты плазмид доступны?
Если вы приняли решение заказать ген в составе плазмиды, вы получите его в виде, готовом к трансформации в E. coli. При заказе гена с длиной менее чем 5000 п.о. вам предложат воспользоваться способом заказа Best-Fit.
В таком случае во время процесса клонирования, желаемый фрагмент ДНК будет встроен в наиболее подходящий вектор, что помогает избежать непредвиденных трудностей с клонировнаием или токсичностью. В таком случае не будет происходить задержек при синтезе.
Гены, длина которых не превышает 1500 п.о. могут быть заказаны в векторе pIDTBlue, если предполагается использование гена в in vitro транскрипции. Аналогично вектору pBluescript II, вектор pIDTBlue содержит большое количество сайтов клонирования в альфа фрагменте гена LacZи в промотерах T3 и T7, по краям сайта встраивания. PIDTBlue плазмида содержит устойчивость к ампициллину.
BACs и гены длиной более чем 5000 п.о.
Гены с длиной более 5000 п.о. поставляются в BAC с устойчивостью к хлорамфениколу. Инструкции по тому, как работать с BAC векторами, на английском языке, могут быть найдены здесь. В таблице 1 представлены все возможные варианты векторов, в которые могут поставляться фрагменты генов.

Таблица 1. Возможные варианты векторов, в которых могут поставляться фрагменты генов.

[attachmentid()=225656]

4. Какие шаги необходимо предпринять, чтобы заказать двухцепочечный ген в компании СкайДжин?

К тексту обзора прикреплены форма для заказа генов, которую можно заполнить и выслать на почту info@skygen.com.
При заполнении таблицы обратите внимание на то, что если ваш ген будет доставляться в плазмиде, необходимо указать сайты рестрикции на 3' и 5' концах и тип антибиотика, к которому должна быть резистентность.
После этого будет сформирована цена, вам будет прислан на проверку скан заказа который надо будет подписать с вашей стороны, и мы попросим заполнить форму безопасности гена, которая также прикреплена к данному обзору.
Для того, чтобы принять решение о возможности осуществить синтез и об его окончательной стоимости, принимаются во внимание следующие факторы:
Вторичная структура: шпильки длиной более 10 оснований, и GC-богатые участки
Повторы и гомополимерные участки: длинные повторы более чем 10 пар для G/C, или более чем 30 пар для A/T
Общее содержание GC более 65% и содержание GCболее 25% в отдельных частях гена
Повторы рестрикционных сайтов и сайт метилирования Dam/Dcm, которые могут влиять на разрезание эндонуклеазами рестрикции

5. Как правильно использовать полученные фрагменты генов gBlocks?
Чтобы облегчить работу наших клиентов, мы предлагаем ряд опробованных и оптимизированных протоколов для использования фрагментов генов gBlocks. Следующие протоколы (на английском языке) - рекомендуются для сборки и амплификации фрагментов gBlocks. Условия работы с фрагментами и инструкции по хранению также включены.
Метод сборки фрагментов генов по Гибсону
В оригинальной статье, в которой был описан методв Гибсона [Gibson et al., 2009], были представлены рекомендации по сборке конструктов, размер которых варьируется от малых бактериальных геномов до миллиона п.о. при помощи этой методики. Тем не менее, IDT предлагает ограничить размер собираемых участков до 2300 п.о. с использованием 4-5 фрагментов. Для сборки рекомендуется использовать готовую смесь Gibson Assembly от компании New England Biolabs, которую также можно заказать в нашей компании.
Протокол можно найти в статье Gibson DG, Young L, et al. (2009)

Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases . Nature Methods 6 (5):343&ndash;345. doi:10.1038/nmeth.1318. PMID 19363495.

Амплификация фрагментов gBlocks

T/A клонирование фрагментов

Клонирование мегапраймеров без этапа рестрикции

В дополнение к приведенным протоколам, можно привести несколько советов по работе с gBlocks.
Клонирование с использованием gBlocks аналогично использованию очень чистого ПЦР-продукта. Для клонирования с рестриктазами важно добавить 6-8 нуклеотидов на концы фрагментов, за пределами рестрикционного сайта узнавания. Большинство ферментов будет терять эффективность, если фрагмент гена будет заканчиваться сайтом рестрикции.
Добавлять на 5&prime;-конце фосфатную модификацию необязательно для большинства задач. Добавление 5&prime; фосфата необходимо для традиционного клонирования по тупым концам. Нельзя добавлять фосфорилирование при использовании Zero Blunt TOPO клонирования.
6. Биологическая безопасность синтезируемых генов
Каждый синтезируемый ген контролируется для избежания содержания в них последовательности, кодирующей потенциально опасных патогенов, каждый пользователь должен подтвердить отсутствие таковых участков в составе заказываемого гена.

Заключение
Мы надеемся, что информация, представленная в этом обзоре, будет полезна и поможет Вам в ваших дальнейших исследованиях.
SkyGen Отправлен 31.03.2015 18:11
  Выделение микроРНК, РНК и ДНК с использованием phenol-free колоночных наборов от Bioline

[attachmentid()=219979]

Мы продолжаем расширять нашу линейку для колоночного выделения нуклеиновых кислот из самых разных образцов. Сегодня мы хотим обратить внимание всех, кто работает с микроРНК, тотальной РНК, а также с образцами тканей в парафине на новинки для колоночного выделения:
Набор для выделения РНК из биологических жидкостей позволяет выделить РНК высокого качества из физиологических жидкостей - крови/сыворотки, мазков изо рта, клеточных культур, вирусов.
Набор для выделения микро РНК и набор для выделения микро РНК из растений позволяют получить тотальную РНК и микроРНК из самых различных образцов (см. Табл.1 в тексте обзора).
Набор для выделения РНК/ДНК из тканей, зафиксированных формалином в парафине позволяет получить геномную ДНК и тотальную РНК хорошего качества из проблемных образцов.
Набор для выделения ДНК/РНК/протеинов позволяет выделить три различных типа макромолекул из одного образца без этапа экстракции органическими растворителями.

Преимущества линейки наборов для выделения РНК от ISOLATE II
1. Безопасность: простой протокол, без использования токсичных химикатов (без фенола)
2. Достоверные результаты: возможность очистить как микро РНК, так и малые РНК (длиной до 200 нуклеотидов) без разрушения, вызываемых использованием фенола
3. Быстрый протокол: без трудоемкого этапа разделения фаз и осаждения спиртом
4. Надежность: без инициируемого фенолом разрушения образцов
5. Использование для дальнейших экспериментов: РНК готова к дальнейшему использованию в большинстве экспериментов.

Было показано, что малые РНК с малым содержанием GC могут быть селективно потеряны при очистке с использованим фенола (Kim et al., Molecular Cell 46(6): 2012).
Таблица 1. Типы образцов, из которых возможно выделять микро РНК, РНК, ДНК и протеины при помощи наборов для выделения ISOLATE II

[attachmentid()=219981]

Давайте подробнее остановимся на каждом из рассматриваемых наборов.

1. Набор для выделение РНК из биологических жидкостей и из вирусов

Типы выделяемой РНК:
1. большие фрагменты мРНК
2. вирусная РНК
3.рибосомальная РНК (rRNA)
4. малые РНК, такие как микроРНК (miRNA) и короткие интерферирующие РНК (siRNA)

Откуда выделяется РНК?
1. кровь/плазма/сыворотка
2. слюна
3. цереброспинальная жидкость (CSF)
4. семенная жидкость
5. вирусы

Откуда выделяется вирусная РНК?
Кроме перечисленных выше типов образцов, также из культивируемых клеток и тканей.
Принцип выделения:
Колоночное выделение с использованием аффинного полимера, связывающего РНК разного размера (используется новый тип silica, к которой преимущественно присоединяются малые РНК). Набор не использует фенол и хлороформ.
Образцы подвергаются лизису в присутствии гуанидиниум тиоционата, и хаотропных солей, которые деактивируют эндогенные РНКазы и позволяют выделить неповрежденную РНК. Затем, геномная ДНК захватывается колонками и удаляется. Добавляется этанол, и РНК переносится в колонку для выделения РНК. Далее, тотальная РНК задерживается колонкой и может быть избавлена от примесей при промывании.
Полученная высокочистая РНК может быть использована в следующих экспериментах:
1. реал-тайм ПЦР (qPCR)
2. реакция обратной транскрипции
3. синтез кДНК
4. секвенирование следующего поколения
5. Nothern blotting

2. Набор для выделения РНК/ДНК из тканей, зафиксированных формалином в парафине
Набор обеспечивает выделение и очистку геномной ДНК и тотальной РНК (включая микроРНК) из образцов тканей в парафине. Зафиксированные в парафине ткани характеризуются образованием связок между нуклеиновыми кислотами и белками, и друг с другом. Фиксация также часто характеризуется фрагментацией ДНК с течением времени. Набор позволяет частично избавиться от модификаций, вызванных формалином, увеличивая качество и выход нуклеиновых кислот.
Разделительный матрикс в составе колонок позволяет отделять РНК и ДНК от других компонентов клеток. Набор не требует использования хлороформа и фенола.
На первом этапе избавляются от парафина при помощи промывки ксиленом и этанолом, далее образцы разлагаются с использованием Протеиназы К и специального буфера. Растворимый лизат собирается для очистки РНК, а оставшийся образец разлагается для выделения ДНК. Лизирующий буфер и этанол добавляются в лизат, содержащий ДНК и РНК и переносят в микроколонки для выделения РНК и ДНК. Связанные нуклеиновые кислоты промываются. Очищенные РНК и ДНК могут использоваться для широкого спектра экспериментов.

3. Набор для выделения микроРНК и набор для выделения микроРНК из растений
Набор был разработан для выделения обогащенной микроРНК (размер составляет &lt;200 нуклеотидов), выделение происходит из следующих образцов:
1. культивируемые клетки
2. ткани млекопитающих
3. бактерии
4. кровь
5. другие биологические жидкости

Какие типы малых РНК выделяются:
1. регуляторные молекулы РНК (такие например как микроРНК (miRNA)
2. короткие интерферирующие РНК (siRNA),
3. транспортные РНК (tRNA)
4. РНК из 5Sсубъединицы (rRNA)
Малые РНК, имеющие длину 20-25 нуклеотидов, вовлечены в регуляцию генной экспрессии при помощи связывания с мессенджер РНК (mRNA)

Принцип выделения
РНК прикрепляется к колонки при помощи аффинного связывания,при этом при помощи размера пор возможно разделить РНК по размеру.
Тотальная РНК, в растворе этанола проходит через связывающую колонку, где большие фрагменты РНК остаются связанными, а малые смываются в супернатант. Далее супернатант, содержащие малые РНК проходит через колонку для выделения малых РНК, где связываются малые молекулы.

4. Набор для выделения ДНК/РНК/протеинов
Набор позволяет выделить и очистить с высоким качеством одновременно следующие три компонента, из одного образца
1. тотальную РНК (включая малые РНК),
2. геномную ДНК
3. белки

Выделение может проводиться из следующих образцов:
1. культивируемые клетки
2. ткани млекопитающих
3. биологические жидкости (включая слюну, мочу, семенную жидкость и кровь)
4. бактерии
5. дрожжи,
6. грибы
7. растения
Особенно набор подходит для исследователей, которые выделяют макромолекулы из особенно ценных, труднодоступных образцов (таких как результаты биопсии), - потому что это позволяет не проводить фракционирование образца. Также, анализ становится более достоверным, вследствие того, что РНК, ДНК протеины получаются из одного и того же образца.
Протокол предотвращает деградацию РНК (при помощи перемешивания образца с гуанидинумом тиоцианатом. Геномная ДНК захватывается и отделяется при помощи ДНК колонки. Оставшийся супернатант погружается в колонку для выделения РНК/протеинов. Далее тотальная РНК (включая микроРНК) связывается с поверхностью колонки, в то время как протеины остаются в растворе. Протеины, оставшиеся в промывном растворе - могут быть нанесены непосредственно на SDS-PAGE гель, для визуального анализа, или очищаться. Набор не содержит фенол и хлороформ.
Возможно исследовать одновременно геном, транскриптом и проводить протеомные исследования в одном образце. Очищенная РНК может быть использована для реал-тайм ПЦР, ПЦР с обратной транскрипцией, Nothern Blotting, экспериментах по секвенированию и экспрессии. Полученная ДНК может быть использована для ПЦР, реал-тайм ПЦР, NGS секвенирования, генотипирования. Белки могут быть использованы для SDS-PAGE, Westertn Blotting, 2-D гелей, масс-спектрометрии.

Заключение
Мы надеемся, что новая альтернатива представленным на рынке методам и продуктам для выделения РНК (и микроРНК) позволит упросить и удешевить проведение экспериментов с использованием РНК. По всем возникающим вопросам, пожалуйста, обращайтесь по электронной почте info@skygen.com!
SkyGen Отправлен 31.03.2015 17:34
  Амплификация полного генома отдельной клетки - решение от New England Biolabs

[attachmentid()=219975]

Часто ли вы оказывались в такой ситуации, когда исчезающе малые количества исходного материала не позволяют думать о продолжении экспериментов? Существуют также ситуации, когда важно использовать ДНК одной единственной клетки. Сегодня все это стало возможно, благодаря появлению новых, высокопродуктивных ДНК-полимераз.

Метод полной амплификации генома клетки особенно актуален для изучения эмбрионального развития, дифференциации стволовых клеток, нейронов и разработки новых подходов для лечения опухолевых заболеваний.

Всем, а особенно тем, кому такие возможности приоткрывают новые двери для шага вперед в их исследованиях, мы расскажем в нашем обзоре про набор для полной амплификации генома клетки PicoPLEX™ WGA Kit от компании New England Biolabs. А также о возможностях секвенирования ДНК материала отдельной клетки.

В каком направлении должны были двигаться исследователи, чтобы иметь возможность увеличить то мизерное количество ДНК и РНК, которое можно получить из одной единственной клетки в миллионы раз и получить количество, достаточное для анализа?

Набор для полной амплификации генома клетки PicoPLEX™ WGA Kit эффективно амплифицирует общую ДНК из одной клетки или ДНК эквивалента одной клетки в 1 миллион раз, с получением 2-5 мг ДНК меньше чем за 3 часа.

Для решения каких задач возможно использовать набор для полной амлпификации генома клетки?

1. Анализ вариаций числа копий (Copy Number Variation, CNV)
2. SNP генотипирование
3. Детекция мутаций
4. Секвенирование

Принцип метода полной амлпификации генома клетки (WGA)

Набор для полной амплификации генома клетки PicoPLEX&trade; WGA Kit позволяет эффективно амплифицировать целиком ДНК, содержащуюся в одной клетке, до суммарного количества в 2-5 мкг за 3 часа (в результате протокола происходит увеличение количества исходной ДНК в 1 миллион раз). Длина получаемых при помощи набора ампликонов варьирует от 200 до 1000 п.н.

[attachmentid()=219976]

Рис.1. Последовательность действий при проведении 3-х шагового протокола амплификации генома одиночной клетки или 15 пг - 15 нг ДНК.</i>

Какие преимущества дает использованием методики полногономной амплификации клетки (WGA)?
1. Возможность амплификации генома отдельно взятой клетки. Эффективность амплификации единичного бластомера и полярных телец достигает 95%.
2. Набор может быть также применен при необходимости амплификации неопределенного малого количества исходного материала (от одной до тысячи клеток или от нескольких пикограмм до нескольких нанограмм ДНК).

3. Метод позволяет одинаково успешно амлифицировать как AT-, так и GC-богатые регионы.
4. Высокая воспроизводимость: коэффициент корреляции между значениями Ct при повторных ПЦР в реальном времени достигает 90%.

5. Специфичность и высокая эффективность метода могут быть наглядно проиллюстрированы (Рис.2.), когда мы сравним рост кривых амплификации одиночного клеточного генома и отрицательного контроля: нарастание сигнала в пробирках с отрицательным контролем происходит с отставанием, как минимум, в 5 ПЦР-циклов.

[attachmentid()=219977]

[i] Рис.2. Амплификационные кривые, полученные при проведении ПЦР при помощи набора для полной амплификации генома клетки в режиме реального времени на приборе Bio-Rad I Cycler iQ.


Другим примером эффективности работы может служить электрофореграмма разделения продуктов ПЦР после использования набора WGA (Рис.3).

[attachmentid()=219974]

Рис. 3 Электрофореграмма разделения продуктов ПЦР в 1,4% агарозном геле. Дорожка 1: отрицательный контроль, дорожки 2 и 3: продукты двух независимых реакций с использованием 15 пг геномной ДНК человека, М: Маркер 2-Log 0.1-10 т.п.н. длин ДНК.

Амплификация полного генома отдельной клетки для последующего секвенирования NGS

Давайте вместе посчитаем: в одной клетке находится 70-100 пг ДНК и порядка 10 пг тотальной РНК (что составит 0,1-0,5 пг мРНК). Для того, чтобы, например, приготовить ДНК библиотеку для NGS с помощью набора NEBNext для Illumina, нам потребуется 1-5 мкг ДНК (в случае набора NEBNext Ultra - 5 нг-1 мкг). Значит, при условии увеличения количества ДНК в 10 000 раз возможно будет создать библиотеку NGS. Для РНК задача усложняется: для использования набора NEBNext для создания библиотеки потребуется 100 нг-1мкг тотальной РНК (10 нг-1 мкг для набора Ultra). Получаемое количество ДНК после использования набора, даже с учетом потерь на очистку, достаточно для проведения NGS эксперимента.

Cостав набора

1. Фермент для экстракции ДНК
2. Фермент для подготовки к амплификации
3. Фермент для амплификации
4. Буфер для экстракции
5. Буфер для разведения фермента для экстракции
6. Реакционная смесь для подготовки к амплификации
7. Реакционная смесь для амплификации
8. Очищенная от нуклеаз вода
9. Температура хранения: -20°С

Примечания:

Пробирки с ферментами следует доставать из холодильника и ставить на планшет со льдом только перед непосредственным их использованием. Остальные компоненты набора можно размораживать на планшете со льдом, а перед использованием их следует перемешать при помощи вортекса.

Набор для полной амплификации генома клетки предполагает работу со сверхнизкими (пикограммы) количествами ДНК, поэтому при работе с ним необходимо соблюдать особую осторожность для предотвращения возможной контаминации.

Мы надеемся, что представленная в данном обзоре информация будет полезна, и поможет вашей работе! Со всеми вопросами и предложениями (в том числе по тематикам обзоров, которые интересные) обращайтесь по электронной почте info@skygen.com, и по телефонам: +7 (495) 215 02 22; +7 (800) 333 12 26
SkyGen Отправлен 18.03.2015 19:09
  Выиграйте конкурс на лучший постерный доклад, и получите сертификат на продукцию компании СкайДжин!

[attachmentid()=219169]

Мы долго думали, как помочь нашим любимым клиентам получить нашу продукцию совершенно бесплатно, и вот придумали!

Мы рады объявить, что компания Скайджин является спонсором 3-ей Международной конференции "Генетика, геномика, биоинформатика и биотехнология растений" (Россия, г. Новосибирск, 17-21 июня 2015 года; http://conf.nsc.ru/plantgen2015) и спонсором проводимого в рамках данной конференции конкурса на лучший постерный доклад. Пять победителей конкурса получат сертификаты компании Скайджин стоимостью 4000 рублей каждый, которые можно будет потратить на приобретение всевозможных ферментов (например, рестриктаз), на реактивы для секвенирования по Сэнгеру, наборы для выделения ДНК и РНК и ферментативной очистки ПЦР-смеси и на многое-многое другое!

Участвуйте в конференции, получайте новый опыт, выигрывайте! А потом обращайтесь к нам и получайте любимые ферменты!


Со всеми вопросами обращайтесь по электронной почте: info@skygen.com, или по телефонам: +7 (495) 215 02 22; +7 (800) 333 12 26
SkyGen Отправлен 06.03.2015 16:26
  Конкурс на лучший доклад от компании СкайДжин в рамках 19 Пущинской школы-конференции "Биология - наука 21 века

[attachmentid()=218540]

В рамках работы 19 Пущинской школы-конференции "Биология - наука 21 века" помимо традиционного конкурса лучших работ по мнению экспертного совета Конференции, проводится конкурс на Лучший доклад секции по версии Компании СкайДжин. Оцениваться будет оригинальность научной идеи, максимальное использование возможностей современного лабораторного оборудования и методических подходов.

Заявить о своем намерении участвовать в конкурсе необходимо направив заявку в свободной форме на адрес оргкомитета конференции orgcom@biology21.ru с темой письма "Конкурс SkyGen" и указанием какие реактивы и каких производителей, приобретенных в компании СкайДжин, Вы используете в своей работе.


Победители определяться в дни проведения Конференции и получат Сертификаты номиналом 12 000, 8000 и 5000 рублей на приобретение реактивов и расходных материалов из ассортимента нашей компании!


Более подробную информацию о мероприятии в Пущино, Вы сможете найти на сайте конференции www.biology21.ru


Мы, со своей стороны, будем чрезвычайно рады, видеть результаты научной работы наших любимых клиентов, и встретить лично и вручить победителям конкурса наши призы!
SkyGen Отправлен 02.03.2015 15:06
  Новые продукты для проведения реакции обратной транскрипции от New England Biolabs

[attachmentid()=218298]

Сегодня мы рады представить всем исследователям, работающим с образцами РНК два абсолютно новых продукта для проведения реакции обратной транскрипции. Это набор для RT-PCR OneTaq One-Step и обратная транскриптаза WarmStart RTx .

В условиях динамичных изменений и постоянного развития методов работы с РНК, исследователи компании New England Biolabs обеспечивают своих клиентов новыми инструментами, которые позволят оптимизировать проведение реакций и ускорить ежедневный протокол. В данном случае, появляется возможность проводить реакцию обратной транскрипции и ПЦР полученной кДНК в один этап при помощи набора RT-PCR OneTaq One-Step . С другой стороны, второй продукт - обратная транскриптаза WarmStart RTx- это первая и единственная на рынке обратная транскриптаза, активируемая при повышении температуры (выше 40&degС).

Проведение реакции обратной транскрипции и ПЦР полученной кДНК

Если вы работаете в лаборатории с образцами РНК, зачастую, после этапа проведения реакции обратной транскрипции следующим этапом является ПЦР полученной кДНК. Таким образом, возможность объединить эти два этапа и провести их в один этап, с использованием ген-специфичных праймеров упростит протокол и ускорит время получения результата исследования.
Набор для RT-PCR OneTaq One-Step содержит три компонента, которые обеспечивают успешное проведение каждого этапа - готовая смесь ферментов OneTaq One-Step содержит ферменты NEB: обратную транскриптазу , ингибитор РНКазы Н, и ДНК-полимеразу One Taq Hot Start.
Protoscript II - является мутантом обратной транскриплазы M-Mulv с уменьшенной активностью РНКазы Н и повышенной термостабильностью. One Taq Hot Start. ДНК-полимераза представляет собой смесь Hot Start Taq и второй полимеразы с редактирующей способностью. Такая комбинация позволяет достичь высокого выхода ПЦР при минимальной оптимизации условий реакции.
Кроме того, в состав набора входят две смеси для постановки реакции: реакционная смесь OneTaq One-Step создает идеальную буферную среду для работы ферментов, входящих в состав набора. В то же время реакционная смесь для нанесения на гель One Taq Quick-Load One-Step содержит красители, которые позволяют нанести образец, по окончании реакции на гель.

Преимущества набора для RT-PCR OneTaq One-Step:

1. Возможность амплифицировать длинные ампликоны длиной до 9 000 нуклеотидов
2. Возможность проведения мультиплексной реакции детектирования (2-3 участка интереса)
3. В качестве матрицы могут быть использованы как образцы РНК, так и ДНК
4. Набор дает возможность детектировать, например, наличие GADPH при количестве 0,1 пг в реакционной смеси

Единственная в мире обратная транскриптаза, активируемая при помощи температуры - WarmStart RTx

Обратная транскриптаза WarmStart RTx - это уникальная, смоделированная in silico РНК-зависимая ДНК-полимераза, которая, благодаря использованию совместно с аптамером ингибирует свою активность ниже 40&degС.
WarmStart Rx позволяет проводить синтез кДНК, с использованием в качестве матрицы РНК и одноцепочечной ДНК.

WarmStart Rx обладает РНК-азной активностью, является надежным инструментом для детектирования РНК в реакции амплификации. Фермент отличается от других продуктов линейки тем, что оптимизирован для использования в реакции обратной транскрипции в условиях изотермальной амплификации (RT-LAMP). Так, при комбинации различных обратных транскриптаз с этапом амплифкации с использованием ДНК-полимеразы Bst.2, WarmStart продемонстрировала наилучшие результаты. Позволяет проводить постановку реакции при комнатной температуре и увеличивают специфичность реакции амплификации.

Преимущества обратной транскриптазы WarmStart RTx
1. Технология WarmStart увеличивает специфичность реакции
2. Увеличенная термостабильность позволяет проводить реакцию при повышенных температурах
3. Ускорение протокола позволяет уменьшать время, затрачиваемое на детекцию
4. Уменьшение количества образца для реакции TR-LAMP (0,1 пг для РНК)& синтеза кДНК (1 пг)


Мы будем рады ответить на ваши вопросы, и порекомендовать другие реактивы для синтеза кДНК, а также продукты, используемые для работы с РНК.

Наш email: info@skygen.com; тел: +7 (495) 215 02 22; +7 (800) 333 12 26
SkyGen Отправлен 27.02.2015 15:22
  Интерактивные Online инструменты от компании New England Biolabs

[attachmentid()=218046]

New England Biolabs предлагает мобильное приложение на телефон NEB Tool и разнообразные интерактивные онлайн-инструменты. Таким образом, планирование эксперимента в современной лаборатории становится еще проще!
Мобильное приложение NEB существует на английском языке для наиболее популярных платформ - iPhone и Android.

При помощи мобильного приложения NEBTools вы сможете:

Использовать Enzyme Finder для того, чтобы выбрать рестриктазу по категории и сайту узнавания.
Найти информация о каждом ферменте NEB
Отсортировать списки ферментов по желаемому признаку
Отправить найденные результаты на ваш email
Найти подходящий буферный раствор при планировании эксперимента с несколькими рестриктазами в одной реакционной смеси
Быстро и просто выбрать высокоточные и сберегающие время ферменты и готовые смеси
Спланировать ваш эксперимент и получить нужную информацию, в том числе о рестриктазах с помощью мобильного телефона, находясь вне лаборатории

Полный список доступных приложений на английском языке можно найти [url=‘‘https://www.neb.com/tools-and-resources/interactive-tools ">тут[/url], а ниже мы остановимся на каждом приложении подробнее.

1. Инструмент для картирования ДНК-последовательностей - DNAsequenceMap

Используйте инструмент для картирования ДНК-последовательностей, чтобы найти и получить информацию о последовательности наиболее популярных плазмид, векторов вирусов и бактериофагов.

Информацию о последовательностях векторов плазмид, генетических картах вирусов и бактериофагов, из каталога New England Biolabs, вместе с таблицами расположения сайтов узнавания рестриктаз можно скачать виде pdf файлов. Последовательности находятся в формате FASTA и/или GenBank.

2. Для планирования эксперимента по клонированию воспользуйтесь NEBcloner™

Если вы используете традиционные методы клонирования, используйте этот инструмент для того чтобы подобрать ферменты и протоколы, которые потребуются для каждого этапа клонировнаия (расщепление, модификация концов, лигирование, трансформация и др.).

3. Вам необходимо заменить одно или несколько оснований в последовательности - вам поможет NEBaseChanger

NEBaseChanger может быть использован для дизайна специфических праймеров, при планировании экспериментов по мутагенезу, который проводится с использованием, например Q5® набора для сайт-направленного мутагенеза. Этот инструмент также подсчитает рекомендуемую температуру отжига на основании информации о праймерах, принимая в расчет несовпадающие пары оснований.

4. Инструмент для выбора ДНК-полимераз PCRSelector

Используйте PCRSelector для того, чтобы выбрать подходящую ДНК-полимеразу для планируемого ПЦР-эксперимента. Работаете ли вы с длинным или сложным ампликоном, GC-богатым или с образцом, представленным в единственном экземпляре, при помощи PCRSelector возможно подобрать правильную ДНК-полимеразу и ее формат.

5. Инструмент для подбора условий одновременного использования двух и более рестриктаз Double Digest Finder

Используйте этот инструмент для правильного подбора буферного раствора, при постановке реакции с использованием двух и более рестриктаз, чтобы сэкономить свое время, уменьшить звездчатую активность и уменьшить потери образца во время очистки.

6. Калькулятор температуры отжига праймеров TmCalculator

Используйте этот инструмент при создании протокола ПЦР для подсчета оптимальной температуры отжига праймеров для конкретного эксперимента. Введите в качестве исходных параметров название ДНК-полимеразы, концентрацию праймеров, и их последовательность. Получите в результате рекомендуемую температуру отжига праймеров.

7. Инструмент для планирования реакции с рестриктазами NEBCutter v.2

Введите свою исходную последовательность ДНК, и найдите все сайты узнавания для всех рестриктаз типа II и коммерчески доступных рестриктаз типа III, которые имеют лишь по одному сайту узнавания участок лишь один раз. Программа учитывает как все рестриктазы, доступные у New England Biolabs, так и другие ферменты.

Максимальный размер вводимого файла последовательности составляет 1 Мб, и максимальная длина последовательности - 300 тысяч оснований. Также программа посчитает частоту разрезания и чувствительность к степени метилирования.

8. Если вы используете наборы для лигирования Gibson Assembly или NEBuilder от NEB - вам потребуется NEBuilder Assembly Tool

NEBuilder&reg; Assembly Tool может быть использован для дизайна праймеров для проведения сборки при помощи [url=‘‘http://www.skygen.com/obzory/ metod_gibsona_dlya_effektivnoy_sshivki_bolshogo_kolichestva_dlinnyh_fragmentov_dvuhtsepopochechnyh_d
nk/"> метода Гибсона [/url], основываясь на введенной последовательности фрагментов, а также ДНК-полимеразы, которая должна использоваться для амплификации. Важно указать количество фрагментов, из которых должна производиться сборка, и тип фермента для ПЦР. Фрагменты могут быть удалены, перегруппированы. В результате вы получаете список требуемых праймеров, температуры отжига и финальную последовательность собираемого конструкта.

9. Найдите свой фермент с EnzymeFinder
С использованием этого инструмента вы сможете найти эндонуклеазу рестрикции по имени, сайту узнавания, типу или степени перекрывания. Укажите свою последовательность, и программа укажет правильные ферменты для разрезания.


10. При помощи NEB Golden Gate Assembly Tool возможно автоматизировть in silico дизайн ДНК с использованием метода Golden Gate

При помощи данного инструмента вы сможете:
- импортировать последовательности в большом количестве форматов, выбрать фрагменты для сборки
- сделать автоматический дизайн праймеров для создания совмещаемых концов или с использованием существующих сайтов разрезания
- сделать дизайн подходящих праймеров и введения точечных мутаций

11. NEBioCalculator®
Используйте инструмент для подсчетов, и перевода единиц для ДНК и РНК. Возможно конвертировать массу в моли, перевести о.е. в концентрацию, разбавление и молярность.

12. База данных InBase
Интеины являются последовательностями, которые разрушают кодирующий регион в гене хозяина. В отличие от интронов, интеины вырезаются послетрансляционно из предшественника протеина при помощи самокатализируемого механизма сплайсинга пртеинов. InBase описывает действие интеинов, включает в себя их список и их свойства. Возможно найти информацию о таких свойствах, как: прототип, эндонуклеазную активность, расположение вырезаемых участков, комментарии по сайту вставки, открывателей и ссылки на литературу.

13. База данных PolBase
Polbase является хранилищем биохимических, генетической и структурной информации о ДНК-полимеразах.

14. База данных REBASE
Используйте этот инструмент в качестве гида в постоянно-меняющемся мире рестриктаз. REBASE - это динамическая, постоянно обновляемая база данных рестриктаз и связанных с ними протеинов.

Мы надеемся, что использование данных программ существенно упростит работу в вашей лаборатории!
SkyGen Отправлен 26.02.2015 15:12
  Скидка 25% на пластик Sorenson всем держателям грантов!

[attachmentid()=217968]

В эти предвесенние дни и до 31 марта, компания СкайДжин объявляет скидку в 25% всем держателям грантов РФФИ, ФАНО, РНФ, Минобр и Минпромторг на имеющийся в наличии пластик Sorenson.

При заказе, просто укажите, в рамках какого гранта будет производиться закупка, и мы предоставим Вам скидку!

Пожалуйста, уточняйте наличие интересующего Вас пластика по электронной почте info@skygen.com, или по телефонам +7 (495) 215 02 22, +7 (800) 333 12 26!
SkyGen Отправлен 24.02.2015 14:10
  Расширение линейки продуктов от английской компании Bioline

[attachmentid()=217867]

Мы с удовольствием сообщаем, что в Новый 2015 год компания СкайДжин входит с новыми продуктами для Вашей лаборатории!
В первом квартале 2015 мы планируем обеспечить Вашу лабораторию реактивами для реал-тайм ПЦР с красителем SYBR Green по крайне доступным ценам. При этом вы сможете использовать Ваш ПЦР-амплификатор любой модели, и проводить любые требуемые вариации экспериментов. Реакцию возможно провести как с использованием референсного красителя ROX, так и без, в то же время возможно проводить эксперимент как с использованием зондов, так и без. Вы сможете использовать в качестве стартового материала как ДНК так и РНК. При этом новейшие технологии позволяют провести реакцию обратной транскрипции РНК и реал-тайм ПЦР кДНК в один этап.
Одновременно, мы расширяем линейку наборов для колоночного выделения и очистки ДНК, РНК и протеинов.
Количественная ПЦР - одно из самых мощных и чувствительных методик для анализа генов, доступных на сегодняшний день. Этот метод принят на вооружение практически во всех лабораториях мира. Его эффективность, особенно для амплификации и определения малых количеств ДНК и РНК, позволила изменить представление о многих типах диагностических исследований. Наиболее важными областями применения является анализ генной экспрессии и детекция патогенов. Другие важные задачи, которые позволяет решать количественная ПЦР - оценка количества мРНК и микроРНК, поиск биомаркеров, оценка количества микробов, выявление вероятности раковых заболеваний.
Итак, мы предлагаем наборы для проведения реал-тайм ПЦР во всех вариантах которые используются на сегодняшний день. Давайте коротко остановимся на вариациях ПЦР.

Реал-тайм ПЦР с красителем SYBR Green I

Для проведения реал-тайм ПЦР мы предлагаем линейку наборов от Bioline: наборы SensiFAST и SensiMix SYBR . SensiFAST - это последнее поколение разработок компании Bioline. Входящие в состав смеси антитела реализуют принцип HotStart во время проведения реакции ПЦР. Характеристики набора позволяют успешно использовать SensiFAST в клинических лабораториях, для определения чрезвычайно малых количеств генов или мультиплексирования.
В состав наборов SensiMix SYBR - предыдущего поколения наборов для проведения ПЦР, входит другой буферный раствор по сравнению с SensiFAST - но эти наборы, обладая все таким же высоким качеством - порадуют вас своей стоимостью.
В состав каждой линейки входят наборы, содержащие высокую концентрацию референсного красителя ROX набор для проведения реал-тайм ПЦР SensiFAST SYBR Hi-ROX, набор для проведения реал-тайм ПЦР SensiMix SYBR Hi-ROX), среднюю концентрацию набор для проведения реал-тайм ПЦР SensiFAST SYBR Lo-ROX, набор для проведения реал-тайм ПЦР SensiMix SYBR Lo-ROX), и не содержащие референсного красителя совсем набор для проведения реал-тайм ПЦР SensiFAST SYBR No-ROX, набор для проведения реал-тайм ПЦР SensiMix SYBR No-ROX). В то же самое время, есть наборы, где кроме SYBR Green I также используется флуоресцеин набор для реал-тайм ПЦР SensiFAST SYBR&флуоресцеин, набор для реал-тайм ПЦР SensiMix SYBR&флуоресцеин).
Наборы для проведения ПЦР в реальном времени SensiFAST были специально разработаны для использования при укороченном времени циклов во время амплификации. С другой стороны, система HotStart не позволяет реакции начаться до активации, и увеличенная скорость копирования ДНК ферментами, наряду с улучшенным составом буфера - все это в совокупности увеличивает воспроизводимость, надежность и производительность наборов для реал-тайм ПЦР.

Реал-тайм ПЦР с использованием зондов

Для проведения реал-тайм ПЦР с использованием зондов мы предлагаем линейку наборов от Bioline: наборы SensiFAST и SensiMix II SYBR.
Так же как при реал-тайм ПЦР без использования зондов, в состав каждой линейки входят наборы, содержащие высокую концентрацию референсного красителя ROX набор для реал-тайм ПЦР с зондами SensiMix II Hi-ROX , набор для реал-тайм ПЦР с зондами SensiFAST Hi-ROX ), низкую концентрацию референсного красителя ROX набор для реал-тайм ПЦР с зондами SensiMix II Lo-ROX , набор для реал-тайм ПЦР с зондами SensiFAST Lo-ROX ), не содержащие референсного красителя ROX набор для реал-тайм ПЦР с зондами SensiMix II No-ROX , набор для реал-тайм ПЦР с зондами SensiFAST No-ROX ).

Реал-тайм ПЦР кДНК и обратная транскрипция образцов РНК в один этап: технология One-Step от Bioline

Новые разработки в области химии буферов позволили объединить этап обратной транскрипции с образцов РНК и этап количественной ПЦР образца кДНК. Таким образом, возможно использовать этот метод при работе с образцами РНК как для реал-тайм ПЦР без использования зондов набор для реал-тайм ПЦР образцов РНК SensiFAST SYBR No-ROX , набор для реал-тайм ПЦР образцов РНК SensiFAST SYBR Hi-ROX , набор для реал-тайм ПЦР образцов РНК SensiFAST SYBR Lo-ROX , набор для реал-тайм ПЦР образцов РНК SensiFAST SYBR&флуоресцеин ), так и с использованием зондов набор для реал-тайм ПЦР образцов РНК с зондами SensiFAST SYBR No-ROX , набор для реал-тайм ПЦР образцов РНК с зондами SensiFAST SYBR Hi-ROX , набор для реал-тайм ПЦР образцов РНК с зондами SensiFAST SYBR Lo-ROX) .
Когда мы говорим о проведении реал-тайм ПЦР, чрезвычайно важным обстоятельством будет являться тип вашего реал-тайм амплификатора, в зависимости от марки которого и от задачи эксперимента, необходимо будет выбирать набор реагентов.
Наборы от Bioline позволяют проводить эксперименты с использованием всех популярных и стандартных амплификаторов: Applied Biosystems (7000, 7300, 7500. 7500 FAST, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT FAST, StepOne, Stepone plus, ViiA7, QuantStudio), Cepheid (SmartCycler), Illumina (Eco), Thermo (Piko Real), Takara (Thermal Cycler Dice), Fludigm (BiomMark), Analytik Jena (qTOWER/qTOWER2), Qiagen (Corbett) (Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000, Rotor-Gen Q), Bio-Rad (iCycler, MyiQ, iQ5, Opticon, Opticon2, Chromo4, MiniOpticon, CFX96, CFX384), Roche (LightCycler 96, LightCycler 480, LightCycler Nano), Eppendorf (Mastercycler ep reallex, Mastercycler ep realplex 2S), Techne (Quantica, PrimeQ), BJS (Xxpress), Agilent (Stratagene) (MX4000P, MX3000P, MX3005P).
Кроме того, мы с удовольствием хотим сообщить, что в первом квартале 2015 года мы расширяем линейку продуктов для колоночного выделения нуклеиновых кислот ISOLATE II, среди новых продуктов: Набор для выделения микро РНК ISOLATE II, набор для выделения микро РНК из растений ISOLATE II, набор для выделения РНК/ДНК/белков ISOLATE II, набор для выделения РНК из биологических жидкостей ISOLATE II, набор для выделения РНК/ДНК из образцов в формальдегиде и парафине ISOLATE II.
Для консультаций по данным продуктам, пожалуйста, обращайтесь по электронному адресу info@skygen.com
Мы надеемся, что представленная в настоящем обзоре информация будет полезна, и позволит вывести ваши исследования на новый уровень, сэкономив ваши средства!
SkyGen Отправлен 24.02.2015 12:50
  Очистка нуклеиновых кислот: многообразие методов и подходов

[attachmentid()=219969]

На сегодняшний день, множество решений для очистки и выделения ДНК представлены на рынке, какой из методов выбрать - это решение, которое принимает каждый индивидуальный исследователь. Методы отличаются друг от друга сферой применения, подходом, задачей, и конечно же ценой. Иногда, исследователям удобнее использовать метод, который для них более привычен, однако следует принять во внимание, что каждый день появляются все более прогрессивные новинки, которые могут существенно помочь и ускорить все процессы в лаборатории.
Сегодня мы постараемся систематизировать наиболее распространенные методы выделения и очистки РНК и ДНК, и рассказать в целом для чего он могут применяться, и, конечно же, предложить отдельные конкретные продукты, которые вы сможете начать использовать уже в ближайшие недели!
В наступившем году, мы приняли решение расширить ассортимент продуктов для выделения и очистки нуклеиновых кислот, для того чтобы помочь нашим клиентам в их ежедневной работе.
До сегодняшнего дня мы предлагали лишь решения по колоночному выделению: наборы для выделения геномной ДНК, ДНК из образцов крови, плазмидной ДНК, ДНК из агарозного геля и из ПЦР продуктов.
На сегодняшний день, множество решений для очистки и выделения ДНК представлены на рынке, какой из методов выбрать - это решение, которое принимает каждый индивидуальный исследователь. Методы отличаются друг от друга сферой применения, подходом, задачей, и конечно же ценой. Иногда, исследователям удобнее использовать метод, который для них более привычен, однако следует принять во внимание, что каждый день появляются все более прогрессивные новинки, которые могут существенно помочь и ускорить все процессы в лаборатории.
Сегодня мы постараемся систематизировать и объяснить наиболее распространенные методы выделения и очистки РНК и ДНК, и рассказать в целом для чего он могут применяться, и, конечно же, предложить отдельные конкретные продукты, которые вы сможете начать использовать уже в ближайшие недели!

Колоночное выделение

Метод колоночного выделения использует способность ДНК и РНК адгезироваться к поверхности материала silica в присутствии хаотропных ионов, и легко смываться в их отсутствии. Данный метод пришел из органической химии, где на первых этапах набивались стеклянные колонки различными материалами, в том числе silica, потом ДНК и РНК смывались, и далее колонка разбиралась и набивалась заново. Чтобы исключить эти трудоемкие этапы, было предложено использовать одноразовые пластиковые колонки, уже с прослойкой silica-мембраны, которые идеально подходят по размеру к обычным пробиркам эппендорф на 1,5 и 2 мл.
Таким образом, приобретая набор для колоночного выделения - вы получаете определенное количество готовых колонок, в них вы добавляете ваш образец, откуда будет происходить выделение ДНК/РНК, в специальном буфере, в условиях которого будет происходить связывание ДНК/РНК c поверхностью мембраны, вставляете пробирку, куда будет собираться свободная от ДНК/РНК жидкость, и центрифугируете. Далее, мембрана промывается - чтобы удалить все ненужные примеси и вещества. После этого, добавляется буфер для смывки нуклеиновых кислот, которые смываются во время центрифугирования в специально подготовленную пробирку. Казалось бы, процесс достаточно прост, почему же существует такое разнообразие наборов для выделения? В том числе и наборы для колоночного выделения ISOLATE II . Основные различия происходят на этапе подготовки образца, содержащего нуклеиновые кислоты. Иногда проведения лизиса не требуется (в случае наборов для выделения ДНК из ПЦР продуктов ), но требуется экстракция (как в случае выделения из агарозного геля ). Требуется лизис бактерий ( набор для выделения плазмидной ДНК ), лизис тканей ( набор для выделения геномной ДНК ). В случае выделения ДНК из крови, существует как протокол выделения ДНК из клеток крови, так и из сыворотки (например, если требуется идентифицировать ДНК вирусов), все это обеспечивает набор для выделения ДНК из крови . Выделение ДНК из крови может быть осложнено добавками к образцам крови различных реактивов для консервации крови, для чего компания Bioline разработала специальные решения.

Энзиматическая очистка ПЦР-продуктов

Несмотря на то, что колоночное выделение - хорошее решение для получения чистых ДНК и РНК, но иногда нужно более дешевое и быстрое решение для специальных нужд. Поэтому, компанией New England Biolabs было предложено новое решение для очистки ПЦР реакции при помощи смеси энзимов. Смесь щелочной фосфатазы и эндонуклеазы VIII удаляет все dNTPи непрореагировавшие праймеры, и, если ДНК/РНК, поступившая в ПЦР реакцию не была загрязнена другими примесями, через 15 минут вы получаете готовый образец для дальнейшего использования для секвенирования по Сэнгеру или NGS или для любого другого назначения, без проведения каких-либо других этапов. Быстрый протокол (время проведения очистки в два раза меньше других аналогов на рынке) низкая стоимость одного выделения, подкрепленные традиционным качеством всех продуктов от New England Biolabs позволят этому набору завоевать сердца множества исследователей.

Очистка ДНК при помощи магнитных частиц

Одним из самых прогрессивных и наиболее совершенных методов очистки ДНК, существующих на сегодняшний день, является очистка ДНК при помощи магнитных частиц. Все чрезвычайно просто - в образец добавляется взвесь магнитных частиц, ДНК адгезируется к ним, потому пробирка ставится в магнитный штатив, магнитные частицы собираются на стенке пробирки, супернатант собирается и удаляется. Потом для промывки частицы ресуспензируются, опять собираются на стенке. На последнем этапе ДНК смывается с магнитных частиц, частицы собираются на стенке, а чистый раствор ДНК отбирается для дальнейших исследований. Мы предлагаем набор Ampliclean для очистки ПЦР-продуктов и набор для очистки реакционной смеси D-Pure Dye Terminator (специально для использования перед секвенированием по Сэнгеру). Плюсы очевидны: ультра чистота продукта, быстрота, простота. Из минусов мы должны отметить более высокую цену в пересчете на реакцию, а также отсутствие других реагентов, если выделение происходит непосредственно из ткани, образца крови или бактериальной культуры.
Так как для проведения очистки на магнитных частица вам понадобятся специальные штативы, содержащие встроенные магниты, например штативы для микропробирок объемом 1.5 мл для магнитного разделения и штатив для 96-луночного планшета для магнитного разделения от New England Biolabs.

Специальные предложения от New England Biolabs для очистки РНК, обогащения мРНК и избавления от рибосомальной РНК

Специально для всех, кто выделяет РНК перед проведением реакции обратной транскрипции, чтобы далее проводить секвенирование или оценку при помощи реал-тайм или классической ПЦР - New England Biolabs предлагает набор для выделения РНК при помощи магнитных частиц, из клеточных культур и тканей, без использования органических реагентов и фенола - набор для магнитной экстракции мРНКа также набор PolyA Spin для экстракции мРНКиз образцов общей РНК при помощи аффинной хроматографии.
В то же время - специально чтобы увеличить эффективность секвенирования образцов РНК, мы рады представить набор NEBNext для избавления от рибосомальной РНКот New England Biolabs.

Выделение ДНК и двуцепоченой РНК при помощи соосаждения

Другой вариацией использования силика-материалов для очистки нуклеиновых кислот является SureClean Plusдля очистки нуклеиновых кислот, представленный компанией Bioline. Чрезвычайно простой и быстрый протокол позволит вам сэкономить время и деньги, а возможность дополнительно использовать розовый краситель упростит визуализацию осадка.
Фракционное разделение РНК, ДНК и протеинов при помощи экстракции
Если начальным образцом вам служит ткань, клетки или культура, из которой требуется отдельно получить ДНК, РНК протеины - то классической реактив TRIsureдля фракционного разделения нуклеиновых кислот и протеинов от Bioline - ваш выбор!

Выделение ДНК при помощи лизиса при нагревании в присутствии полимерных материалов

Мы не можем обойти вниманием очень интересной решение от Nimagen: реактив GenePurgeDirect для выделения ДНК и РНК, для проведения протокола выделения ДНК и РНК из крови, бактериальных культур, тканей в парафине, образцов биопсии, хвостов мышей, растений и инфекционных агентов (например MTB, HIV) вам потребуется амплификатор или микроволновая печь.
GenePurgeDirect® состоит из полимерных материалов, которые обеспечивают быстрое извлечение нуклеиновых кислот из клеток в форме, которую можно использовать для ПЦР. Ингибиторы ПЦР, высвобождающие во время лизиса и другие вещества, которые могут принять участие в реакции ПЦР, сегрегируются с полимерным материалом, и супернатант, содержащий нуклеинвые кислоты, может быть использован напрямую для ПЦР. Протокол выделения занимает до 10 минут.

Заключение

Чтобы не запутаться среди большого разнообразия продуктов на рынке, хочется посоветовать две важных вещи, которые следует принять во внимание: имейте в виду, что стоимость следует оценивать исходя из цены в пересчете на одну вашу реакцию (с вашим объемом реагента), и что чем больше содержится количества реакций/объема в упаковке, тем дешевле выйдет одна очистка. Мы надеемся, что информация в нашем обзоре поможет удачно выбрать реактив для очистки и оптимизировать исследования.
Посмотреть тему (откроется в новом окне)

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 23.07.16 12:07
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft