Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Очистка His6-меченного белка на Ni-NTA колонке -- comments to a permanent page of the site --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Тема связана с: His6-меченные белки
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Forum robot
Постоянный участник
на сервере в Москве



 прочитанное сообщение 22.08.2005 22:55     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Экспрессия и очистка полигистидин меченных белков. Приготовление стоковой культуры. Препаративная культура. Приготовление осветлённого лизата. Определение ёмкости Ni-NTA агарозы. Препаративная очистка (элюция имидазолом; элюция кислым буфером). Регенерация Ni-NTA агарозы.
Участник оффлайн! Nameless
Постоянный участник
CA



 прочитанное сообщение 22.08.2005 22:55     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

BCA protein assay вообще довольно чувствителен к имидазолу (для micro допускается 12.5 мМ, macro - 50 mM). У меня например белки снимаются в основном 250 мМ имидазолом, т.е. в микро-модификации разведение 1:10 уже не катит, а 1:20 - на пределе допустимой концентрации. Советую для белков в имидазоле использовать BioRad Protein assay kit.

Всего благодарностей: 2Поблагодарили (2): Fedo, bio-1985
Участник оффлайн! Fedo
Постоянный участник
Nemetchina



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  24.08.2005 00:48     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Spasibo tebe Nameless. Kak raz predstoit skoro chistit' belok s 6His... A v labe toka BCA protein assay. Budem vybivat' BioRadovskij Kit ))
Участник оффлайн! Nameless
Постоянный участник
CA



 прочитанное сообщение 24.08.2005 17:29     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Нет, вообще конечно можно и тем пользоваться, но надо чтобы имидазол в пробах был меньше 12.5 мМ или чтобы белка было очень много и мерять его макроБСА. У меня белка было немного и снимал я его в 250 мМ, поэтому и не получалось.
Участник оффлайн! Nameless
Постоянный участник
CA



 прочитанное сообщение 24.08.2005 18:50     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Да, кстати о птичках. Тут на днях наши звонили в Biorad и получили информацию что пластиковые эппендорфы при нагревании до 60 градусов (как это рекомендуется в ВСА assay) выделяют вещество которое поглощает как раз в том диапазоне волн в котором рекомендуется проводить измерения (562). Так что НА САМОМ ДЕЛЕ они рекомендуют или ставить при 37 в пластике или при 60 но в стеклянных пробирках. Вот такие пироги.
Так что если у кого результаты не сходятся - звоните в биорад, получайте ответ - и бегом к шефу smile.gif wink.gif beer.gif
Guest
IP-штамп: frlkSmZr37YvE
гость



 прочитанное сообщение 24.08.2005 19:17     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

так там калибровка делается в тех же условиях, так что весчество везде выделяется - и в опыте и в контрольных образцах
Участник оффлайн! Nameless
Постоянный участник
CA



 прочитанное сообщение 25.08.2005 21:07     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

Оно то понятно, но ведь хрен же его знает, как на него повлияет наличие вашего белка и компонентов буфера в котором он растворён.
_enisseisk_
IP-штамп: frftLGqhpFF.A
гость



 прочитанное сообщение 11.01.2006 03:57     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

1. вообще-то все то же самое можно делать и в денатурирующих условиях - см. напр., протокол(ы) на <a href="http://www.qiagen.com." target="_blank">www.qiagen.com.[/url] Это может быть полезным в случае, когда белок плохо растворимый, подвергается агрегации итп. Выходы при этом - выше, а белок можно потом диализовать, если нужно.
2. с нативной очисткой - тоже должно все работать, но можно при лизисе (озвучивание во льду) добавлять еще и ингибиторы протеаз, например, ФМСФ до 100 мкМ. Остальные - дело вкуса.
3. тип сорбента - тоже может иметь значение. Qiagen-овские неплохи, но и от Sigma (Ni-CAM HC) ничего. И для FPLC годится.
Участник оффлайн! serhiosus
Участник
Minsk



 прочитанное сообщение 05.05.2007 15:18     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

Вопрос. Насколько я понимаю, глюкоза не мешает индукции с помощью IPTG (сам индуцирую 0,5 мМ IPTG при наличии в среде 0,5% глюкозы). Зачем тогда уксложнять процедуру индукции за счет отмывки клеток?
Участник оффлайн! Esya
Постоянный участник
PA, USA



 прочитанное сообщение 06.05.2007 23:48     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

(Nameless @ 24.08.2005 15:29)
Ссылка на исходное сообщение  Нет, вообще конечно можно и тем пользоваться, но надо чтобы имидазол в пробах был меньше 12.5 мМ или чтобы белка было очень много и мерять его макроБСА. У меня белка было немного и снимал я его в 250 мМ, поэтому и не получалось.

Ага, если белок кумассей красится, то бредфорд завсегда лучше, не надо забывать, что мелочь всякая зачастую плевать на биорадовскую краску в кислоте хотела. А БСА он без претензий, все меряет и даже альбумин можно в качестве стандарта часто использовать.
Гость
IP-штамп: fr3h//j.zHZU.
гость



 прочитанное сообщение 08.05.2007 10:56     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

Подскажите пожалуйста при работе с Ni-NTA колонкой можно ли использовать ДТТ или β-меркаптоэтанол
Участник оффлайн! Tom1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.05.2007 13:33     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

НЕТ
Участник оффлайн! Kaa-g
Участник



 прочитанное сообщение 08.05.2007 14:15     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

А по-моему β-меркаптоэтанол можна, у меня лизис буфер с β-меркаптоэтанол и белок выделяется и колонку использовал несколько раз лаж небыло еще, а вот ДТТ однозначно нельзя.
Гость
IP-штамп: fr3h//j.zHZU.
гость



 прочитанное сообщение 08.05.2007 14:40     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

А почему, что там происходит??
Дело в том, что хроматография на Ni-NTA прошла с ДТТ и все поделилось и почистилось, но только в процессе работы колонка из зеленовато голубой превратилась в бурокоричневую, но потом при отмывке имидазолом, эта бурая окраска сошла с белком и теперь препарат белка светлокоричневый. А колонка опять нормального цвета.
Разница между βмэ и ДТТ только в дополнительных SH и ОН группах следовательно и реакция ионов никеля будет с ними одинаковой???
А как же работают на Ni-NTA с белками, которым нужны ДТТ и βмэ???
Участник оффлайн! Tom1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.05.2007 15:42     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

меняют ДТТ и мео на цистеин....
Участник оффлайн! Esya
Постоянный участник
PA, USA



 прочитанное сообщение 08.05.2007 16:03     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

мео можно аж до 20 мМ - иногда размер, то есть число групп, важен smile.gif ДТТ - хелатор, а МЭО - нет tongue.gif
Еще можно TCEP - пользовать

Это если никелевый сорбент пользовать, кобальтовый и МЕО плохо переносит по другим причинам. Читайте инструкцию.

Сообщение было отредактировано Esya - 08.05.2007 16:05
Участник оффлайн! bio-1985




 прочитанное сообщение 05.09.2007 17:02     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

Привет всем. Подскажите, пожалуйста, методики выделения His6-меченного белка в денатурируюдщих условиях. Кто встречался с деградацией белка из-за протеаз при хранении и очистке? Как с этим боролись? Какие ингибиторы, кроме PMSF и леупептина, использовали?
Гость
IP-штамп: frsCQkPH3djzA
гость



 прочитанное сообщение 09.01.2008 19:29     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

"Привет всем. Подскажите, пожалуйста, методики выделения His6-меченного белка в денатурируюдщих условиях. Кто встречался с деградацией белка из-за протеаз при хранении и очистке? Как с этим боролись? Какие ингибиторы, кроме PMSF и леупептина, использовали?"

посмотрите на 23 стр этого протокола:

http://www.emdbiosciences.com/docs/docs/PROT/TB273.pdf
Гость
IP-штамп: frsCQkPH3djzA
гость



 прочитанное сообщение 09.01.2008 19:35     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

"Кто встречался с деградацией белка из-за протеаз при хранении и очистке? Как с этим боролись?"

EDTA 1mM
EGTA 0.5mM
20% glycelol, можно до 50% glycerol (тогда колонку после нанесения элюирующего буфера лучше центрифугировать).
guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 09.01.2008 22:43     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

Дык есть коктейли из ингибиторов. Но ..., Что еще? Температуру пониже все делать на 0-4С, для хранения белок лиофилизовать хранить на -70 в двойной герметичной таре, в наружной таре держать активированный селикагель.

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 22.02.19 06:17
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft