Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
ASDF Постоянный участник |
Только экспериментировать никому не хочется, мне то точно. Нужен набор готовый с буферами. А если его будет легко купить, например в хеликоне, то .... я бы с удовольствием покупал. Многие, я уверен тоже. |
genseq Постоянный участник |
|
ASDF Постоянный участник |
(genseq @ 21.10.2014 10:58) На практике не проверял, но теоретические основы таковы: 1. pH<7 (сильно закислять нет смысла). 2. Обязательно "посолить" (например, NaCl >0,3 M). 3. ЭДТА Низкая pH снижает отрицательный заряд силики и концентрацию гидроксилов в растворе. Соль предотвращает отталкивание ДНК отрицательно заряженной силикой. Достаточно 0,2 М, но для полной гарантии добавляют до 0,4 М. ЭДТА - чтобы убрать магний. Связыванию ДНК он не мешает, но может затруднить десорбцию. Так что можно попробовать (теоретически) NaAc 0,3 М + 1 mM ЭДТА pH 6,0. А спирт здесь не нужен ? |
genseq Постоянный участник |
|
genseq Постоянный участник |
Сорбционные свойства вопросов не вызывают. Они проверялись неоднократно. Осталось уточнить следующие вопросы: 1. Стоит ли "округлять" размеры частиц до 1,5 мкм (спустить половину частиц в унитаз)? 2. Какое название дать этому магносорбенту? Главное - название, поскольку "как вы яхту назовёте, так она и поплывёт" (Врунгель). Какие будут предложения? |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Конечно можно и МагноСеком назвать Распределение впечатляет. |
Cathie22 Постоянный участник |
МагноСил, по-моему, есть уже. Силекс, само собой... В моих складах названий есть неиспользованный УниМаг А не хотите просто, как на этикетке - магнитный силикагель? |
genseq Постоянный участник |
Magnogene is a medicine available in a number of countries worldwide. UNIMAG - это интерактивный журнал о моде, музыке, искусстве, событиях, интересных местах и персонах. www.unimag.ua Интернет магазин - Экологичные товары: электровелосипеды, электросамокаты, электромобили, альтернативная энергетика, спорт, туризм, здоровье, ... Пока лидирует последнее предложение - "Магнитный силикагель". Но оно подходит только для России, в которой потенциальных потребителей такого продукта можно пересчитать по пальцам. Хотелось бы иметь ещё и англоязычный вариант названия. Не уверен, что для этого подойдёт прямой перевод - "magnetic silica gel". |
Cathie22 Постоянный участник |
|
ASDF Постоянный участник |
|
genseq Постоянный участник |
(ASDF @ 27.11.2014 19:56) Чтобы приготовить стрептавидиновые бидзы нужно купить стрептавидин. А чтобы что-то купить нужно что-то продать. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(genseq @ 28.11.2014 10:10) Чтобы приготовить стрептавидиновые бидзы нужно купить стрептавидин. А чтобы что-то купить нужно что-то продать. .. или банк ограбить. |
genseq Постоянный участник |
Ещё нужно получить аналог AMPure XP (или SPRI), т.е. карбоксилированные частицы в 20% ПЭГ c 2,5 М NaCl. Карбоксилирование недавно освоил, но в первой партии частицы получились со средним диаметром 0,6 мкм. Работать должны не хуже полуторамикронных, но могут хуже ресуспендироваться после промывки этанолом и подсушивания. Придётся укрупнять. Сообщение было отредактировано genseq - 26.12.2014 10:07 |
Guest IP-штамп: frSfVMJ6ZRZsc гость |
|
genseq Постоянный участник |
Надеюсь в январе разобраться с размерами частиц, закупить ПЭГ 8000 (пока есть только ПЭГ 6000) и замесить первую партию препарата. Проверять хотел сам, но за помощь в этом деле буду очень признателен. |
Guest IP-штамп: frSfVMJ6ZRZsc гость |
|
ASDF Постоянный участник |
|
avial Постоянный участник |
А XTerminator АБИшный - это какие частицы? Сообщение было отредактировано avial - 04.01.2015 22:01 |
genseq Постоянный участник |
(avial @ 04.01.2015 19:41) А для целей обычной очистки из гелей или выделения ДНК чем карбоксилированные лучше обычных силикатных? Только упрощением протокола и отсутствием органики? А XTerminator АБИшный - это какие частицы? Для обычной очистки ДНК из геля карбоксилированные ничем не лучше силикатных. Для выделения ДНК из таких источников как кровь, клетки и т.п. пригодны только силикатные. Карбоксилированные захватывают слишком много грязи. Преимущества карбоксилированных (осаждения ПЭГом) проявляются при очистке ДНК от дНТФ, ферментов, праймеров, праймерных димеров, а также мелких (<100...200 п.о.) и крупных (>500 п.о.) фрагментов. А это как раз то, что нужно в NGS для приготовления библиотек ДНК. Правда, ПЭГ можно заменить изопропиловым спиртом, но не всегда. С ПЭГом можно использовать и силикатные частицы, но это снижает качество очистки. Поэтому после завершения разработки силикатных частиц я даже не пытался сделать такую замену. XTerminator - это, похоже, амфотерный ионообменник. Удаляет не только дНТФ, но и соли. Скорее всего, эпплайдовцы его усовершенствовали - покрыли ПАГом или каким-то другим мелкопористым гелем, предотвращающим связывание ДНК. Сообщение было отредактировано genseq - 06.01.2015 12:57
|
criplenie Участник |
Аналог АМПура был бы полезен также тем кто занимается клонированием/мутагенезом и прочим лигированием, тут надо делать наборы и рекламироваться. Тем более при нынешнем курсе рубля. Некотоыре извращенцы с ампуром даже плазмиды выделяют: Вот кстати еще идейка для набора:
|
criplenie Участник |
(genseq @ 03.01.2015 18:38) Надеюсь в январе разобраться с размерами частиц, закупить ПЭГ 8000 (пока есть только ПЭГ 6000) и замесить первую партию препарата. Проверять хотел сам, но за помощь в этом деле буду очень признателен. Я с 6000 делал (и с ацетатом аммония вышло лучше чем с NaCl). Правда через полгода похоже растворчик окислился и теперь ингибирует ПЦР. Но первый месяц все работало. |
genseq Постоянный участник |
Сообщение было отредактировано genseq - 21.05.2015 16:50 |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(genseq @ 21.05.2015 17:38) Расфасовал последнюю партию силикатного магносорбента. Получилось три десятка пузырьков по 20 мл "магнитного силикагеля" (5% w/v; 25% v/v). Однако, партия! Пирамидкой красиво лежат, созревают, как вино. Беру. Сообщение было отредактировано -Ъ- - 21.05.2015 17:16
|
genseq Постоянный участник |
(-Ъ- @ 21.05.2015 15:15) Они не лежат, а стоят. Это вид сверху. Одна девушка просила дать на пробу немного магносорбента. Предлагал отправить по почте, но она хочет забрать лично, причём именно у тебя. Если не возражаешь, на этой неделе привезу "пирамидку" к тебе (для раздачи девушкам). Для серьёзных потребителей на днях приготовлю ещё пару литров. Флаконы для неё (20 шт. на 100 мл) вчера заказал в Китае. Пора увеличивать объёмы производства. |
genseq Постоянный участник |
|
ASDF Постоянный участник |
|
avial Постоянный участник |
Из 200 мкл цельной крови в 200 мкл воды (или ТЕ - тут не уверен), растворы почти без изменений взяты от колонок, 260/230 из-за плохо отмытого гуанидина. Работают частицы.
|
wyzandrea123 |
|
genseq Постоянный участник |
Исходя из неё причиной высокой специфичности связывания нуклеиновых кислот на таких сорбентах является образование связей Si-O-P при pH<7, гидролизующихся в щелочных условиях. Оказывается, специалистам эта реакция давно известна. Вот что ответила на моё письмо ведущая специалистка Института химии силикатов Т.А.Кочина: В принципе, в пп. 6 и 7 все изложено. Хемосорбция поверхностью силикагеля соединений фосфора была описана еще в 1971году. На первой стадии происходит замещение силанольных групп SiOH, которые всегда присутствуют на поверхности силикагеля, на Si-O-P, т.е. происходит прививка фосфорсодержащих соединений к поверхности силикагеля (хемосорбция). При последующем гидролизе происходит расщепление привитых групп Si-O-P с образованием групп P-OH и Si-OH (десорбция). Скорость гидролиза возрастает с увеличением рН среды. Сообщение было отредактировано genseq - 18.10.2015 12:01 |
Sileks |
1. Почему магнитные частицы способностью сорбировать нуклеиновые кислоты, белки обладают огромное количество материалов начиная от металлов и не только металлов, их оксидов, сложных органических молекул и много-много других. Силика оказалась, что называется под рукой. Самой дешевой и достаточно эффективной. Комбинирование силикатного покрытия с магнитной основой просто логическое продолжение хорошо отработанного метода, дающее преимущество собирать частицы из большого объема без использования центрифуги. Сегодня существуют частицы с совершенно разными покрытиями, позволяющие избирательно выделять нуклеиновые кислоты или белки с определенными свойствами, характеристиками и размерами. 2. Почему каждый не синтезирует свои частицы синтез магнитных частиц с любыми покрытиями при небольшой затрате времени можно найти в бесконечных количествах статей. Сегодня некоторые из таких частиц может синтезировать даже школьник у себя дома на кухне. Это не особенно сложно. И самое замечательное - эти частицы будут что-то выделять. Но основная проблема - приспособить частицы для конкретной задачи. И вот тут начинается та работа за которую наши уважаемые клиенты платят свои деньги. Частицы являются таким же компонентом набора, как и соли, и другие компоненты. Сами по себе они ничто. Только вместе с правильно подобранными компонентами в нужных соотношениях и последовательностях их использования достигается конечный эффект. Так что можно сказать, клиент покупает не магнитные частицы, а ноу-хау по их использованию. И в результате набор становится системой, позволяющей стандартизовать процедуру. Это очень важно при выделении из большого количества образцов, чтобы результат был воспроизводим и его можно было сопоставить с предыдущими результатами. 3. зачем переплачивать за чужие наборы в любой работе каждый для достижения результата выбирает одно из двух - время или деньги. Если вам нужно быстро получить результат, а не осваивать азы по лабораторному практикуму - вы покупаете набор, выполняете работу, публикуетесь, становитесь известными в своей области, получаете гранты и работаете дальше. Если у вас нет денег и есть много времени, то вы вникаете в детали процедур, набиваете шишки и ломаете ноги о подводные камни и рано или поздно вы все будете знать, что и как должно быть в любом наборе и, может быть, откроете свою собственную фирму. Что выбирать - решать вам. 4. и все-таки, из чего состоят буфера для выделений из разных компонентов. На разработку буферов уходит масса времени. Если кто-то на форуме пишет, что он понюхал и там 100% этанол, изопроп и т.д., а в буфере таком-то наверняка гуанидин, могу вам с почти 100% уверенностью сказать - в мясной сосиске есть мясо. Лучший способ узнать правду и получить правильный совет - не спрашивать на форумах, а обратиться к производителю. Если сможет - ответит. Если не сможет, по крайней мере не будет вводить в заблуждение. Желаю всем успехов!
|
blij Постоянный участник |
(Sileks @ 12.12.2015 02:05) Лучший способ узнать правду и получить правильный совет - не спрашивать на форумах, а обратиться к производителю. Если сможет - ответит. Если не сможет, по крайней мере не будет вводить в заблуждение. Лучший способ узнать загадочный состав - посмотреть список патентов, которые перечисляются в описании продукта. По кр. мере можно узнать в каком направлении копать. Спрашивать производителя - пустая трата времени и свидетельство потрясающей детской наивности вопрошающего.
|
пацанчег IP-штамп: frblw0cK.g9Hg гость |
|
genseq Постоянный участник |
Исходя из этих литературных данных попытался приготовить частицы с полиакриламидным покрытием, пропитанным поликремниевой кислотой. Пробный вариант отличался повышенным дзета-потенциалом. Повысилась и сорбционная ёмкость. Оседают частицы "полиакриламидного силикагеля" не быстрее обычных, но диаметр увеличился примерно в 2 раза - до 2...3 мкм. Осталось проверить влияние сроков хранения. Если через год свойства не ухудшатся, то начну ими приторговывать. Сообщение было отредактировано genseq - 31.05.2016 09:07 Файл/ы:
|
Panaev Постоянный участник |
(blij @ 12.12.2015 05:14) Лучший способ узнать загадочный состав - посмотреть список патентов, которые перечисляются в описании продукта. По кр. мере можно узнать в каком направлении копать. Спрашивать производителя - пустая трата времени и свидетельство потрясающей детской наивности вопрошающего. Не все так категорично. За спрос денег не берут, но иногда отвечают искренне. Прецеденты были. Конечно, не всегда. |
genseq Постоянный участник |
(Guest @ 03.01.2015 11:56) генсек, а вы cooh частицы пробовали в деле с ПЭГом? Если вам интересно я могу их потестировать на библиотеках и сравнить с АМпуром. Хотя у меня хороший запас АМпуров, они неоправданно дороги и я (да и не только я, как мне кажется) с удовольствием заменил бы их на местный продукт. Dear ASDF, прошу прощения за то, что переключился с разработки AMPure RU на обзоры и проекты по NGS. Обязуюсь до конца года вывести на рынок первую партию данного препарата, отличающегося от всех прочих аналогов особо низкой ценой и высоким качеством. Тем более, что деньги на реактивы появились. Спрос на магнитные штативы и сорбенты понемногу растёт. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
1 М хлорид натрия уже сам по себе антисептик. Но как среда для шариков - не помеха. Хотел сказать, что азид можно уже не добавлять. На своих добавляю побольше азида (до 0,1%) и держу рН ниже 8. Про сроки хранения понятно (что может произойти со стеклом), но таки советую дать один год (для тебя же лучше - больше будут покупать. Сообщение было отредактировано -Ъ- - 05.09.2016 11:09 |
genseq Постоянный участник |
(-Ъ- @ 05.09.2016 09:06) Генсек камень точит. 1 М хлорид натрия уже сам по себе антисептик. Но как среда для шариков - не помеха. Хотел сказать, что азид можно уже не добавлять. На своих добавляю побольше азида (до 0,1%) и держу рН ниже 8. Про сроки хранения понятно (что может произойти со стеклом), но таки советую дать один год (для тебя же лучше - больше будут покупать. Спасибо за дельные советы. Правда, с азидом всё не так просто. В магносорбенты он добавляется не столько для устранения прорастания, сколько для блокировки окисления магнетита. Правда, у меня частички и без него покрыты фосфатом, но азид, по крайней мере теоретически, может пролезать в "промежности", недоступные для фосфатов. С pH ситуация понемногу проясняется. Оказалось, что сорбционные свойства зависят от дзета-потенциала, а он в щелочной среде понемногу снижается. В кислой среде перегруппировки силанольных связей не идут, поэтому дзета-потенциал намного стабильнее. Посему препараты теперь подкисляю. Нужно бы поставить серию экспериментов по оценке влияния pH на стабильность дзета-потенциала при длительном хранении, но своего прибора не имею, а заказывать такую серию накладно. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
А что есть дзетта потенциал даже не заморачиваюсь. Ну конечно если это надо публиковать в Натуре... |
genseq Постоянный участник |
Приятно работать, когда никто не торопит. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(genseq @ 27.10.2016 21:32) Это точно! А когда голова не болит где бы деньги достать на приятный отпуск... зимой - это ващеее. |
genseq Постоянный участник |
(genseq @ 04.09.2016 07:33) Dear ASDF, прошу прощения за то, что переключился с разработки AMPure RU на обзоры и проекты по NGS. Обязуюсь до конца года вывести на рынок первую партию данного препарата, отличающегося от всех прочих аналогов особо низкой ценой и высоким качеством. Тем более, что деньги на реактивы появились. Спрос на магнитные штативы и сорбенты понемногу растёт. В сентябре имел неосторожность пообещать доделать AMPure RU. Тогда конец года казался очень далёким. Обещание выполнил, но только частично. Конечного продукта до сих пор нет. Зато удалось получить карбоксилированный магносорбент с диаметром частиц как у AMPure XP - 1,5 мкм. Причём по очень простой технологии. После Нового Года займусь масштабированием его производства и подбором рецептуры для стабилизации ПЭГ. Главное - не торопиться. Тем более, что торопиться некуда. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(genseq @ 20.12.2016 20:36) В сентябре имел неосторожность пообещать доделать AMPure RU. Тогда конец года казался очень далёким. Обещание выполнил, но только частично. Конечного продукта до сих пор нет. Зато удалось получить карбоксилированный магносорбент с диаметром частиц как у AMPure XP - 1,5 мкм. Причём по очень простой технологии. После Нового Года займусь масштабированием его производства и подбором рецептуры для стабилизации ПЭГ. Главное - не торопиться. Тем более, что торопиться некуда. Это в каком смысле стабилизировать? |
genseq Постоянный участник |
(-Ъ- @ 21.12.2016 08:53) Это в смысле подобрать анитоксиданты и т.п., которые замедлят или устранят накопление всякой гадости, образующейся при хранении растворов ПЭГ. Немного информации на эту тему есть здесь:
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(genseq @ 21.12.2016 13:15) Это в смысле подобрать анитоксиданты и т.п., которые замедлят или устранят накопление всякой гадости, образующейся при хранении растворов ПЭГ. Немного информации на эту тему есть здесь: В качестве антиоксидантов, не открывая америку: меркаптоэтанол, DTT, серосодержащую аминокислоту... А в качестве консерванта, если рН позволяет (кстати, какой?), азида и проклинчика. Хотя сомневаюсь, что нужна ли вообще стабилизация в среде с 2-3 М NaCI. |
genseq Постоянный участник |
1. Налажен синтез силикатных магносорбентов. Не уверен, что лучших в мире, но уверен, что не худших. А по стоимости - самых дешёвых (20 мл 5% концентрата - 6 тыс. руб.). 2. Разработана технология синтеза карбоксилированных магносорбентов. Выход магнитных частиц у неё в 5 раз меньше, чем у силикатных. Но если концентрат доводить до 1 % (по сухому весу), а не до 5% (как у силикатных), то конечный объём получится такой же - около 0,5 л за один цикл приготовления. Причём технология легко масштабируется, так что можно получать концентрат и литрами. 3. Пора браться за главное - за разработку AMPure RU. Поэтому "прошерстил" литературу по накоплению перекисных соединений в эфирах (к которым относится и ПЭГ). Картинка начинает проясняться. Но однозначное решение отсутствует, поэтому со стабилизацией ПЭГ придётся поэкспериментировать. Надеюсь, что уже на следующей неделе. Сообщение было отредактировано genseq - 02.09.2017 14:03 |
Vadim Sharov Постоянный участник Россия |
|
genseq Постоянный участник |
Банка с особо чистым ПЭГ8000 лежит давно. Чистый (хч) NaCl получил на прошлой неделе. Вчера на почте забрал посылку с главным антиоксидантом - эктоином. Обычно ограничиваются добавлением одного азида натрия, но он плохо ловит супероксидные радикалы. Карбоксилированные частицы магнетита окислил до гамма-гематита, чтобы свести к минимуму их окисление, и выдержал около полугода. Мелких примесей в этой партии нет совсем. Есть примесь крупных частиц, но её убрать совсем не сложно. Основная фракция идеально ложится в оптимальный диапазон (~1,5 мкм). Осталось только перемешать всё это в нужных пропорциях. На следующей неделе буду готов обеспечить всех желающих пробными образцами. Заявки на пробники можно присылать через форму обратной связи на сайте magnoshop.ru: Сообщение было отредактировано genseq - 27.10.2017 17:53 |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(genseq @ 27.10.2017 18:51) Наконец-то всё готово для приготовления AMPure RU. Банка с особо чистым ПЭГ8000 лежит давно. Чистый (хч) NaCl получил на прошлой неделе. Вчера на почте забрал посылку с главным антиоксидантом - эктоином. Это с каких пор эктоин стал антиоксидантом? Стабилизирующее влияние оказывает, но в данном случае, как бы сказать, - не в кассу. Как возникло такое решение? |
genseq Постоянный участник |
Сообщение было отредактировано genseq - 30.10.2017 19:19 Файл/ы:
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
- зацветания среды, - гидролиза и пр. модификации функциональных групп, - ну и окисления тоже, конечно. Протекторные свойства эктоина, в отличие от того же DTT, имеют совсем другую природу. А может тебе повезет, и на небосклон взойдет суперзвезда! |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |