Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Soulmate |
Поначалу работы с RAPD выявлялись четко 3 бэнда на форезе. Все было прекрасно, зоны воспроизводились несколько раз. Был выявлен полиморфный фрагмент. В реакции используем пару 10 нуклеотидных random праймеров. Отжиг на 36 градусов. В один грустный день и до сего момента (больше года прошло) бэнды перестали четко проявляться: на форезе или мазня или слабые-преслабые зоны, полиморфного фрагмента вообще не видно. Перепробовано: грешили на ДНК, выделена свежая - нет изменений. грешили на компоненты реакции - все поменяли на новое - нет изменений грешили на праймеры - заказали новые - ничего. грешили на амплификатор - поставили на другом - ничего меняли температуру отжига - получше, но не то, что было раньше. концентрацию ДНК перемеряли - тоже не в ней дело. Праймеры на концах схлопываются...ну допустим. Чего ж раньше не схлопывались? Получалось же!!! Я в недоумении, руки опускаются. Подсказать никто не может. Наверное на мне молекулярное проклятье))) Что вообще происходит? Кто работал с этим рапдом? ПАМАГИТЯ!!! Сообщение было отредактировано Soulmate - 19.12.2014 18:44 Картинки: ihaveaproblem.jpg — (103.33к) |
MMM Постоянный участник |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Soulmate @ 19.12.2014 19:33) Что поменяли? Название есть у "компонентов"? Характеристики? Очевидно, что надо спрашивать у продавца компонентов чего он нахимичил. В (-) тоже шмеры? |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(MMM @ 19.12.2014 20:21) Не все так просто в РАПДе, Маниатис. |
yorik |
(Soulmate @ 19.12.2014 19:33) Проблема затяжная. Поначалу работы с RAPD выявлялись четко 3 бэнда на форезе. Все было прекрасно, зоны воспроизводились несколько раз. Был выявлен полиморфный фрагмент. В реакции используем пару 10 нуклеотидных random праймеров. Отжиг на 36 градусов. В один грустный день и до сего момента (больше года прошло) бэнды перестали четко проявляться: на форезе или мазня или слабые-преслабые зоны, полиморфного фрагмента вообще не видно. Перепробовано: грешили на ДНК, выделена свежая - нет изменений. грешили на компоненты реакции - все поменяли на новое - нет изменений грешили на праймеры - заказали новые - ничего. грешили на амплификатор - поставили на другом - ничего меняли температуру отжига - получше, но не то, что было раньше. концентрацию ДНК перемеряли - тоже не в ней дело. Праймеры на концах схлопываются...ну допустим. Чего ж раньше не схлопывались? Получалось же!!! Я в недоумении, руки опускаются. Подсказать никто не может. Наверное на мне молекулярное проклятье))) Что вообще происходит? Кто работал с этим рапдом? ПАМАГИТЯ!!! вытиньти 10 меры ф тувалет возьмите 18 20 меры арбитрари праймед ПЦР и гоняйте на 20 сантиметров ПАГАХ с окраской СИБР гольдом получите 40 полиморфов в дорожку |
yorik |
(Soulmate @ 19.12.2014 19:33) Проблема затяжная. Поначалу работы с RAPD выявлялись четко 3 бэнда на форезе. Все было прекрасно, зоны воспроизводились несколько раз. Был выявлен полиморфный фрагмент. В реакции используем пару 10 нуклеотидных random праймеров. Отжиг на 36 градусов. В один грустный день и до сего момента (больше года прошло) бэнды перестали четко проявляться: на форезе или мазня или слабые-преслабые зоны, полиморфного фрагмента вообще не видно. Перепробовано: грешили на ДНК, выделена свежая - нет изменений. грешили на компоненты реакции - все поменяли на новое - нет изменений грешили на праймеры - заказали новые - ничего. грешили на амплификатор - поставили на другом - ничего меняли температуру отжига - получше, но не то, что было раньше. концентрацию ДНК перемеряли - тоже не в ней дело. Праймеры на концах схлопываются...ну допустим. Чего ж раньше не схлопывались? Получалось же!!! Я в недоумении, руки опускаются. Подсказать никто не может. Наверное на мне молекулярное проклятье))) Что вообще происходит? Кто работал с этим рапдом? ПАМАГИТЯ!!! не связыватся с РАПД особенно на 10 мерах |
yorik |
|
yorik |
(Soulmate @ 19.12.2014 19:33) Проблема затяжная. Поначалу работы с RAPD выявлялись четко 3 бэнда на форезе. Все было прекрасно, зоны воспроизводились несколько раз. Был выявлен полиморфный фрагмент. В реакции используем пару 10 нуклеотидных random праймеров. Отжиг на 36 градусов. В один грустный день и до сего момента (больше года прошло) бэнды перестали четко проявляться: на форезе или мазня или слабые-преслабые зоны, полиморфного фрагмента вообще не видно. Перепробовано: грешили на ДНК, выделена свежая - нет изменений. грешили на компоненты реакции - все поменяли на новое - нет изменений грешили на праймеры - заказали новые - ничего. грешили на амплификатор - поставили на другом - ничего меняли температуру отжига - получше, но не то, что было раньше. концентрацию ДНК перемеряли - тоже не в ней дело. Праймеры на концах схлопываются...ну допустим. Чего ж раньше не схлопывались? Получалось же!!! Я в недоумении, руки опускаются. Подсказать никто не может. Наверное на мне молекулярное проклятье))) Что вообще происходит? Кто работал с этим рапдом? ПАМАГИТЯ!!! какие полимеразы какой циклер |
Guest IP-штамп: fr53Mfolz7edU гость |
|
RNK Постоянный участник СССР |
2. уменьшить концентрацию геномной ДНК 3. повысить отжиг с 36 до 50 градусов 4. сменить ПЦР буфер на менее эффективный, чем той что рекомендуется для полимеразы (меньше магния, без Tween 20/Triton X100) 5. потенциально - снизить концентрацию праймеров в 2-3 раза
|
Guest IP-штамп: fr4I3qoC2Qq4. гость |
А также полимеразу на менее активную и циклер на более тормознутый. А зарплату на менее высокую -не-а? |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Guest @ 21.12.2014 20:14) Канешна, в эпоху NGS заниматься RAPD... Но все равно есть желание помочь человеку, фотки выложил. Повторяю свой встречный вопрос: В минус (без ДНК) контроле тоже есть шмеры? |
RNK Постоянный участник СССР |
вот новое направление подходит Multicolor Super-Resolution DNA Imaging, для решения очень широких задач, даже шире чем в NGS и тем более у RAPD: а на счёт воспроизводимости RAPD, то это метод воспроизводим как любой другой, в том числе и NGS, всё дело в чьих руках. А NGS это очень сырой метод и намного чувствителен к качеству ДНК и всем этапам, на этом фоне RAPD - чудо метод. Сообщение было отредактировано RNK - 22.12.2014 19:05
|
RNK Постоянный участник СССР |
(Guest @ 21.12.2014 22:05) отличный совет для прекрасной методики- сменить буфер на МЕНЕЕ эффективный. А также полимеразу на менее активную и циклер на более тормознутый. А зарплату на менее высокую -не-а? есть такие ПЦР ситуации, когда оптимальный ПЦР буфер - зло. для одновременной амплификации нескольких полос, может быть оптимальным буфет тот, который "помогает" всем полосам одновременно амплифицироваться, а не самому эффективному ампликону, во вред остальным Эта очень серьезная проблема в ПЦР, и решается с большим трудом, и сейчас главным образом преодолевается за счет эмульсионного ПЦР. |
lager |
(Guest @ 21.12.2014 20:14) в принципе метод воспроизводимый просто ручки не из того места растут |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(lager @ 22.12.2014 20:28) термоблок тестировать. |
Soulmate |
Я понимаю негодование по поводу RAPDa. Но доделать вроде надо. Зря я что ли вожусь битый год над этим. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
|
Pharmaсol Постоянный участник |
мда.. было время |
Panaev Постоянный участник |
в какие города... Навеяло |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
чтобы попасть туда. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Soulmate @ 25.12.2014 22:19) В - контроле шмер нет... Я понимаю негодование по поводу RAPDa. Но доделать вроде надо. Зря я что ли вожусь битый год над этим. Возможно в реакции незаметно от Вас появился денатурирующий агент типа глицерина, формамида т.д. Спросите у продавца что они "там" изменили. |
Guest01 |
(Pharmaсol @ 25.12.2014 23:49) помню занимались несколько лет назад полиморфизмами у ячменя, пробовали RAPD, в итоге из-за нестабильности результатов отказались в пользу SSR-маркеров. мда.. было время |
Guest01 |
|
Guest01 |
(Pharmaсol @ 25.12.2014 23:49) помню занимались несколько лет назад полиморфизмами у ячменя, пробовали RAPD, в итоге из-за нестабильности результатов отказались в пользу SSR-маркеров. мда.. было время все прекрасно воспроизводится учи матчасть Була т С . А. , Мироненк о Н . В . Полиморфиз м дрожжеподобног о гриб а Aureo - basidiu m pullulan s (D e Вагу) , выявляемы й в полимеразно й цепно й реакци и с универсальным и праймерами : состояни е дивергенци и вид а / / Генетика . 1992 . Т . 28 , N 4 . С . 19—29 . |
Guest01 |
(Soulmate @ 19.12.2014 19:33) Проблема затяжная. Поначалу работы с RAPD выявлялись четко 3 бэнда на форезе. Все было прекрасно, зоны воспроизводились несколько раз. Был выявлен полиморфный фрагмент. В реакции используем пару 10 нуклеотидных random праймеров. Отжиг на 36 градусов. В один грустный день и до сего момента (больше года прошло) бэнды перестали четко проявляться: на форезе или мазня или слабые-преслабые зоны, полиморфного фрагмента вообще не видно. Перепробовано: грешили на ДНК, выделена свежая - нет изменений. грешили на компоненты реакции - все поменяли на новое - нет изменений грешили на праймеры - заказали новые - ничего. грешили на амплификатор - поставили на другом - ничего меняли температуру отжига - получше, но не то, что было раньше. концентрацию ДНК перемеряли - тоже не в ней дело. Праймеры на концах схлопываются...ну допустим. Чего ж раньше не схлопывались? Получалось же!!! Я в недоумении, руки опускаются. Подсказать никто не может. Наверное на мне молекулярное проклятье))) Что вообще происходит? Кто работал с этим рапдом? ПАМАГИТЯ!!! 3 бенда ето не рапд возьмите хороший циклер типа Верити Фаст праймеры от 18 20 нт агароза как предпрогонка потом 20 сантиметров ПАГ |
Guest01 |
(Pharmaсol @ 25.12.2014 23:49) помню занимались несколько лет назад полиморфизмами у ячменя, пробовали RAPD, в итоге из-за нестабильности результатов отказались в пользу SSR-маркеров. мда.. было время а если гином неизвесен ты кабы сам будешь доби вать СССРы - А вдруг ты завтра попадёшь на остров в океане? - На остров, вот здорово. - А как же ты там проживёшь без повара, без няни? - А я найду кого-нибудь. -Да хорошо бы кабы-так, Но мы-то знаем, Что этот остров, Что этот остров, Что этот остров, Необитаем. -Необитаем? -То есть абсолютно. - Подушек нет, матрасов нет, Нет ни одной кроватки. - А я на травке буду спать. - Простудишься на травке. - Костёр, костёр, костёр. - А я велю разжечь костёр. - Но мы же знаем, Что этот остров, Что этот остров, Что этот остров, Необитаем. - Что, совсем необитаем, да? - То есть абсолютно. |
hoddy |
|
MAAccountancy |
|
watchesbiz Постоянный участник |
|
nigoal123 IP-штамп: frpXPq5TOmUHs гость |
thought leadership while |
Lucille Robinson |
including NGS, the whole thing is in whose hands. And NGS is a very crude method and is much more sensitive to the quality of DNA and all stages |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |