Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* ДНК не осаждается
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Lenochgge




 прочитанное сообщение 05.09.2016 09:33     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Добрый день!
Хочу спросить Вашего совета.
У меня есть плазмидная ДНК примерно 40000 пн, я ставлю рестрикцию ClaI (New England Biolabs), далее хочу переосадить, чтобы избавиться от буфера соотвественно.
Проблема в том, что ДНК никак не хочет выпадать в осадок (крайне плохо), хоть в изопропаноле, хоть в этаноле, и так и сяк...
Может кто-нибудь знает, в чем может быть причина?
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 05.09.2016 10:25     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Какая концентрация ДНК? Вы добавляете соль (ацетат калия, аммония или натрия) перед добавлением спирта?

Сообщение было отредактировано MMM - 05.09.2016 11:04
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 05.09.2016 10:53     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

ДНК садится, но Вы ее далее теряете, видимо. Выводы делаете неверные.
Соосадитель поможет, работайте на китах...

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): NMR-guy
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 05.09.2016 10:58     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Что такое "не выпадает в осадок"? Если имеете в виду видимый осадок, то у чистых препаратов ДНК осадок абсолютно прозрачен. Или после центрифугирования и растворения невидимого осадка в растворе отсутствует ДНК?

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): NMR-guy
Участник оффлайн! Lenochgge




 прочитанное сообщение 05.09.2016 12:59     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Не знаю, как вставить конкретному адресату)

МММ: концентрация ДНК в реакционной смеси – 20-30 нг/мкл, всего беру 1-2 мкг ДНК. Добавляю NaAc (рН 5.2) до 0,3 М, затем либо этанол (2 объема), либо изопропанол (1 объем), пробовали по-разному.

-Ъ-: Возможно, ДНК и садится. Но затем не растворяется. То, что мы теряем осадок (т.е. фактор криворукости) – маловероятно, т.к. параллельно несколько раз уже резали эту же ДНК в тех же количествах другим ферментом в другом буфере, и после этого всё прекрасно садилось и растворялось. Соосадитель пробовали – линейный акриламид, декстран, гликоген, всё пробовали… в случае с ClaI в буфере cutsmart ничего не помогло.

Genseq: да, вы абсолютно правы, ДНК у нас хорошего качества, осадка не было видно даже когда выделяли большой препаратив, хотя самой ДНК выделилось много. Т.о., как Вы сказали, после ц-ф и растворения невидимого осадка в растворе отсутствует ДНК (измеряем концентрацию на флуорометре QUBIT – считанные нг в мкл, наносим на форез – ничего). Повторюсь, что при аналогичных осаждениях с другими ферментами в другом буфере таких проблем нет.
Участник оффлайн! Sergeant
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 05.09.2016 13:20     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Добрая Маша до вас отбирарала ClaI грязным носиком с екзонуклеазой. В результате СlaI не только щепит по сайту рестрикции, но и разрушает фрагменты до нуклеотидов.
А потом удивляемся:"Куда далась ДНК?" smile.gif
Участник оффлайн! Lenochgge




 прочитанное сообщение 05.09.2016 13:24     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

Sergeant: сразу после рестрикции отбираю аликвоту на форез, все там отлично выглядит smile.gif
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 05.09.2016 13:35     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

Спирт исходный не разбавленный? Раньше знаете такое часто случалось. yes.gif

Если изопропанолом, ДНК легко "скользит и выбрасывается" вместе с супером. Лучше с этанолом и соот. охлаждением, по классике.

Всего благодарностей: 3Поблагодарили (3): NMR-guy, Lenochgge, dk
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 05.09.2016 15:45     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

-- концентрация ДНК в реакционной смеси – 20-30 нг/мкл
Не густо. Попробуйте подсушить в токе азота раза в 2-3(кстати в этом случае ацетата можно добавлять поменьше, потому что в буфере есть свой ацетат) . Охладить до 0 или даже -5 и ледяного(-20) спирта сверху, потом на -20 на сутки, двое, потом открутить.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Lenochgge
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 05.09.2016 17:17     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

(Lenochgge @ 05.09.2016 07:33)
Ссылка на исходное сообщение  Добрый день!
Хочу спросить Вашего совета.
У меня есть плазмидная ДНК примерно 40000 пн, я ставлю рестрикцию ClaI (New England Biolabs), далее хочу переосадить, чтобы избавиться от буфера соотвественно.
Проблема в том, что ДНК никак не хочет выпадать в осадок (крайне плохо), хоть в изопропаноле, хоть в этаноле, и так и сяк...
Может кто-нибудь знает, в чем может быть причина?

купите QiaexII (Qiagen) и будет вам счастье

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Lenochgge
Участник оффлайн! Flyamer
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 06.09.2016 01:33     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

На AMPure XP можно почистить еще вместо переосаждения. Я все на них чищу...
Участник оффлайн! Lenochgge




 прочитанное сообщение 06.09.2016 07:47     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

-Ъ-: спирт 96%-ный, поставляется на весь институт smile.gif

MMM: большое спасибо за совет, попробую. А густо сложно сделать с моей ДНК, к сожалению

Flyamer: а ограничения по длине ДНК у нее есть? а то в наличии колонки для очистки, так у них до 15000 пн у всех почти, не берут никакие
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 06.09.2016 09:56     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

Если у вас есть сефадекс типа Г10,25,50, то микроколонка для замены буфера делается из 200мкл наконечника или 200мкл семечки для ПЦР за 10'. Например 50мкл сефадекса уравновешивается новым буфером потом проба объемом от 5 до 15мкл наслаивается на сефадекс до полного впитывания затем проба вытесняется рассчитанным объемом нового буфера. Для 5 мкл пробы надо добавть 7-10 мкл при этом то что вытекает снизу отбрасыается, а следующие 5-10(можно 7) собираются. Если проба 15 мкл, то наносят 15-20мкл и сразу начинают собирать пробу и собирают все 15-20 мкл. Хитрость в том, что ДНК движется в свободном объеме колонки, который для 50 мкл равен примерно 15 мкл.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Lenochgge
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 06.09.2016 10:57     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

Народный умелец. lol.gif
Блох никто не подковывает нынче, они в кроссовках бегают. tongue.gif
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 06.09.2016 11:01     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

(Lenochgge @ 06.09.2016 08:47)
Ссылка на исходное сообщение  -Ъ-: спирт 96%-ный, поставляется на весь институт smile.gif

MMM: большое спасибо за совет, попробую. А густо сложно сделать с моей ДНК, к сожалению

Flyamer: а ограничения по длине ДНК у нее есть? а то в наличии колонки для очистки, так у них до 15000 пн у всех почти, не берут никакие

До 15000 это длиннее или короче? Если попробуете, Вас не будут пытать. yes.gif
На мой взгляд, нет такой четкой границы.
Пардон конечно, а как мелко щепит Cla I?

Сообщение было отредактировано -Ъ- - 06.09.2016 11:03
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 06.09.2016 14:00     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

(-Ъ- @ 06.09.2016 11:57)
Ссылка на исходное сообщение  Народный умелец. lol.gif
Блох никто не подковывает нынче, они в кроссовках бегают. tongue.gif

У кого то есть деньги на кроссовки(которые могут и раскиснуть под дождичком или еще какой фокус выкинуть), а у кого-то нет, но есть сефадекс. К тому же, когда работаешь с открытой системой, а не с черным ящиком, всегда знаешь чего от нее можно ожидать. Например, в данном случае плевать какого размера ДНК, лишь бы это был не десяти базный олиг и не 100 мегабазный геномный фрагмент. Все будет работать от сотни баз до мегабаз.
Участник оффлайн! NMR-guy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 06.09.2016 15:31     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

(Lenochgge @ 06.09.2016 07:47)
Ссылка на исходное сообщение
MMM: большое спасибо за совет, попробую. А густо сложно сделать с моей ДНК, к сожалению

Вы слышали что-либо о вакуумном концентраторе с холодильником? Может у вас в лабе или у соседей он даже есть?

Скорее всего у Вас проблема с аккуратностью, так как ДНК-осадок прозрачный и его легко при удалении супернатанта удалить засосав в носик вместе с супером. Если перед выделением плазмида есть и фиксируется, да еще и 40кДа, то при выделении она никуда деться не может. А если девается - легко отыскивается путем постановки геля со всеми отходами выделения (кроме лизис-буфера, эти отходы весь гель испортят если их не высолить).
Участник оффлайн! Flyamer
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 06.09.2016 17:53     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

(Lenochgge @ 06.09.2016 08:47)
Ссылка на исходное сообщение 
Flyamer: а ограничения по длине ДНК у нее есть? а то в наличии колонки для очистки, так у них до 15000 пн у всех почти, не берут никакие

У AMPure? Да нет, я фосмиды (как раз в районе 40 Кб) чистил, да и геномку тоже, кажется.

Сообщение было отредактировано Flyamer - 06.09.2016 17:53
Участник оффлайн! Lenochgge




 прочитанное сообщение 07.09.2016 09:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

МММ: о, спасибо. Сефадекс как раз есть, что-то чистили на нем очень давно. А то с током азота проблематично((

-Ъ-: у нас несколько наборов в лабе для очистки, но, к сожалению, везде пишут ограничение по длине ДНК максимум 15000 пн, и все были опробованы для 40000, никто не берет( В моем случае ClaI призвана просто линеаризовать плазмиду в одном месте. Место очень важно, так что заменить на другую рестриктазу не могу. Есть только изошизомер отечественного производства, с которым все в порядке с осадком, но его качество говорит против него

А мне нравятся самоделки больше "кроссовок". Контролировать можно лучше все стадии. Я щелочным методом с собственными растворами выделяю мелкие плазмиды лучше, чем современными китами smile.gif

NMR-guy: концентратор есть eppendorf, но он не охлаждает, там только 30,45 и 60 температуры. Концентраторы среди закомых как-то не шибко популярны. То есть, вы бы порекоммендовали поставить гель со всеми спиртами для переосаждения? (лизис буфера нет в данном случае)

Flyamer: AMPure - так его еще купить надо)

странно, что после других любых буферов все чистится на ура хоть изопропанолом, хоть спиртом, а вот как smartCut (NEB), так все, хотя состав без выкрутасов
50mM Potassium Acetate
20mM Tris-acetate
10mM Magnesium Acetate
100μg/ml BSA
pH 7.9@25°C
Участник оффлайн! Lenochgge




 прочитанное сообщение 07.09.2016 09:47     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

MMM: сколько лет надо проработать и что читать, да и что делать вообще, чтобы знать столько методов и вариантов? сейчас в статьях-то не шибко распространяются, да и в книгах тоже
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 07.09.2016 10:17     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

Handbooks старые надо читать. Микроколонки из сефадекса описаны в русском переводе маниатиса 30 летней давности. Если честно, то надо просто проявлять интерес к технологиям и к пониманию их механизмов. Т.е. хорошо бы иметь понимание биологических, биохимических и физико-химических основ процессов, которые используются в той или иной технологии. И тогда достаточно лет 5-10, что бы уже более или менее свободно плавать во всяких мануалах. Еще бы хоршо бы, добавить курс физической и коллоидной химии, для химиков или химиков технологов, к тому поверхностному курсу, который читают на биологических и уж тем более на медицинских специальностях.

Всего благодарностей: 4Поблагодарили (4): buchweizen, NMR-guy, Lenochgge, dk
Участник оффлайн! Lenochgge




 прочитанное сообщение 08.09.2016 13:59     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

MMM: у меня новый Маниатис в оригинале, там ничего уже про эти колонки нет((
Участник оффлайн! Veshka
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 11.09.2016 14:25     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #23 множественное цитирование

Ну в конце-то концов. Давайте вспомним и то, что и в старом Маниатисе не написано за незнанием ими древних выкрутасов белковиков. Берём диализный мешок. Берём ПЭГ 40000 и растворяем в нужном буфере (15-20%). Через пару часов у вас в наличии концентрированная ДНК в нужном буфере без ПЭГа. Если количество соли в ДНК не очень важно, то можно без ПЭГа обойтись, взяв в качестве диализного высокосолевой буфер. Эффект тот же.

Всего благодарностей: 2Поблагодарили (2): Lenochgge, dk

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 18.02.20 19:27
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft