Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Micio Москва |
Прежде чем вставлять в геном мыши, ген нужно будет наработать при помощи ПЦР с геномной ДНК (размер продукта 18кб), затем ввести в середину гена однонуклеотидную замену, заменить промотор на индуцибельный и вставить в геном мыши. Совет нужен по тому как лучше ввести однонуклеотидную замену в этот ген и как заменить промотор. Также нужен совет какой промотор лучше выбрать. Заранее спасибо за любые советы, а также критику. |
R-J-Dio Постоянный участник |
|
ship Постоянный участник Moscow |
Будет вероятно сильно меньше 18 кб, зависит от гена. Клонировать естественно по кускам и потом собирать. Как заменить промотор? да очень просто. не клонировать в плазмиду нативный, а вместо него поставить индуцибельный. какой индуцибельный взять? сложно сказать не знаю что у вас за ген, какие научныее цели и тп. ну например доксициклин индуцибельный. мышам в воду добавлять доксициклин. как вставить замену в ген? с помощью ПЦР-мутагенеза. но честно говоря, если вы задаете такие вопросы - то стоит начать с азов генной инженерии и молекулярного клонирования. |
Micio Москва |
(ship @ 28.04.2018 13:04) Задача какая научная у вас? Как вариант можно сделать миниген, удалив протяженные интроны. Будет вероятно сильно меньше 18 кб, зависит от гена. Клонировать естественно по кускам и потом собирать. Как заменить промотор? да очень просто. не клонировать в плазмиду нативный, а вместо него поставить индуцибельный. какой индуцибельный взять? сложно сказать не знаю что у вас за ген, какие научныее цели и тп. ну например доксициклин индуцибельный. мышам в воду добавлять доксициклин. как вставить замену в ген? с помощью ПЦР-мутагенеза. но честно говоря, если вы задаете такие вопросы - то стоит начать с азов генной инженерии и молекулярного клонирования. Чтобы сделать миниген нужно знать какие интроны можно выкинуть? ПЦР-мутагенез для 18 кб подойдет? В принципе используют для вставки в геном полноразмерный ген или предпочитают ограничиться кДНК версией? |
ship Постоянный участник Moscow |
(Micio @ 28.04.2018 11:00) Чтобы сделать миниген нужно знать какие интроны можно выкинуть? ПЦР-мутагенез для 18 кб подойдет? В принципе используют для вставки в геном полноразмерный ген или предпочитают ограничиться кДНК версией? дизайн минигена индивидуален в каждом случае. обычно убирают самые протяженные интроны. для 18 кб мутагенез?? еще раз повторю, разберитесь с азами молекулярной биологии, прежде чем ставить такие задачи. мутагенез делать в небольшом фрагменте гена и потом собирать полную конструкцию. можно полноразмерный , можно кДНК. для экспрессии трансгена очень часто важно наличие интронов. поэтому в идеале полноразмерный, но может и кДНК работать хорошо. все индивидуально для каждого гена. не проверишь -не узнаешь. |
Micio Москва |
(ship @ 28.04.2018 19:31) дизайн минигена индивидуален в каждом случае. обычно убирают самые протяженные интроны. для 18 кб мутагенез?? еще раз повторю, разберитесь с азами молекулярной биологии, прежде чем ставить такие задачи. мутагенез делать в небольшом фрагменте гена и потом собирать полную конструкцию. можно полноразмерный , можно кДНК. для экспрессии трансгена очень часто важно наличие интронов. поэтому в идеале полноразмерный, но может и кДНК работать хорошо. все индивидуально для каждого гена. не проверишь -не узнаешь. спасибо за ответы, мутагенез 18 кб и сборка гена все таки не азы молекулярной биологии. Буду благодарен за качественное пособие на эту тему (сборки больших генов, минигенов). Мутагенез на небольшом фрагменте я представляю как делать. |
ship Постоянный участник Moscow |
(Micio @ 28.04.2018 21:14) так и надо делать на небольшом. вы же хотите 1 нуклеотид заменить. а вы говорите о 18 кб. пособий нет, мы пока свои результаты не опубликовали)) сборка гена - ну ПЦР по кускам, секвеникруете что ПЦРили, выбираете сайты рестрикции геномные и по ним собираете. при сборке минигена главное проверить паттерн сплайсинга, прежде чем трансгенов делать. надо убедится что удаление интронов не влияет на правильность сплайсинга. если задача экспрессировать мутантнй белок - то можно начать с кДНК в плазмиде с каким нибудь гетерологичным интроном, чтобы сплайсинг как факт шел. типа pCAG вектор |
R-J-Dio Постоянный участник |
|
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |