Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Shushashu |
Проводила получение фибробласт мышиных эмбрионов, после чего красила Романовским-Гимза, было все нормально (рисунок приложен) Потом решила провести трансфекцию кальций-фосфатным методом и полученная картинка (тоже приложена) не очень радует, что с ними могло случиться? Встраивала плазмиду рEGFP-N3, несущую ген gfp, при 470 светится, все хорошо, но клетки выглядят не очень здоровыми... Подскажите, пожалуйста, кривые руки или стечение обстоятельств и кривые руки? Картинки: 2.jpg — (1.29мб) 1.jpg — (1.8мб) |
Леонид В Постоянный участник Квебек |
|
Дядя ФАКСер Постоянный участник Nothern Maccaronia, Ticinum |
Топикстартеры! Данный раздел форума предназначен для обсуждения вопросов связанных с методами клеточных технологий (сепарация клеток, криопрезервация, клеточная терапия, инструментальные методы в клеточной биологии- как то микроскопия, проточная цитометрия и т.п.) а никак не базовых методик. Поэтому, с вопросами вида "где достать протокол для ficoll- центрифугирования", "сколько пирувата добавлять в среду" или "контаминация в среде выпуска 19хх года"- пожалуйста, в раздел "Молекулярная и клеточная биология".
|
IIM Постоянный участник Heidelberg |
|
Shushashu |
(IIM @ 26.05.2017 18:00) Первая культура 24 часовая (первый снимок), с нее произведен пересев (второй снимок). На втором снимке культуре 72 часа (после трансформации прошло 48 часов с одной заменой среды через 24 часа) Могла ли культура изменить так морфологию из-за трансфекции? |
Shushashu |
(Дядя ФАКСер @ 26.05.2017 17:55) Прошу прощения, в следующий раз буду внимательнее |
LMP Постоянный участник |
на момент трансфекции: - каков был процент конфлюентности? * Если вам надо наблюдать эффект в течении 72ч, я бы больше 30 не делал. - антибиотики были при трансфекции? * они вляют - сыворотку меняли? * некоторые ставят оптимем, и клеткам эта перемена не очень нравится |
Shushashu |
(LMP @ 26.05.2017 22:39) Попробую уточнить: на момент трансфекции: - каков был процент конфлюентности? * Если вам надо наблюдать эффект в течении 72ч, я бы больше 30 не делал. - антибиотики были при трансфекции? * они вляют - сыворотку меняли? * некоторые ставят оптимем, и клеткам эта перемена не очень нравится Процент конфлюентности был 80, антибиотики не добавляла, так как не вела отбор на селективной среде, сыворотку меняла 72 часа, потому что до трансфекции 24 часа и после неё до анализа еще 48 часов. Меньше 48 не получается, ибо тогда сама трансфекция не происходит |
LMP Постоянный участник |
|
Sergeant Постоянный участник |
2. Что бы разобраться нужны контроли. 3. Взять другую плазмиду и лучше другой протокол выделения 4. Пару альтернативных протоколов трансфекции. кальцый-фосфат очень травматичный для многих типов клеток. Фюджен или Амакса на порядки лучше (но естественно не дешевле) 5. Вирусы тоже хороши. Например ленти. PS 1' Поставить тест на апоптоз If it looks like a duck, swims like a duck and quacks like a duck, then it probably is a duck. |
ship Постоянный участник Moscow |
Амакса зачем? это же порация, думаете прибор есть? может пусть лучше шушашу расскажет о цели своей работы? тогда и можно будет чтото конкретное посоветовать. фибробласты растут как звери и , как было сказано выше, тут дикий перерост. плюс, невнятно описано что и как рассевали и культивировали. от трансефкции pEGFP никакого апоптоза или токсичности быть не может. |
Леонид В Постоянный участник Квебек |
(LMP @ 27.05.2017 05:13) Ну вот, клеток поменьше раза в 2, на старте, и FBS можно 0,5% сделать. Они и не перерастут и считать их проще будет кальций-фосфатная трансфекция с клетками в два раза меньше? это сколько ж тогда нужно ДНК? подобные методы трансфекции требуют высокой конфлюэнтности, но потом надо с ней бороться: рассевать через несколько часов, добавлять мало сыворотки, снижать температуру ... словом танцы с бубном. На любителя.
|
Shushashu |
|
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |