Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Коррекция параметров ПЦР -- Калибровка параметров мастер микс --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Настя14145




 прочитанное сообщение 15.04.2019 15:52     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Добрый день, уважаемые молбиологи. Понимаю, что здесь уже множество раз поднимался вопрос о составе ПЦР-смеси (в том числе в разделе " методы"), но надеюсь все же на Ваши холодные головы, потому что руки уже опускаются.

Проводится генотипирование по конкретному гену (мелкий рогатый скот).

Праймеры CTCTGCCTGCCCTGGACT
GGAGAAGCAGAAGGCAAC

ПЦР смесь: Вода-16,7 мкл, буфер Taq (х1)-2,5 мкл, dNTP (10 mM) - 0,5 мкл, прймеры (100 mM)- по 0,5 мкл, MgCl2 (30 mM)-3 мкл, Taq полимераза (конц 5000 е. а./мл)-0,3.

были опробованы 2 температурных протокола:
1. 94 С-5 мин
2, 95 С-30 сек
3, 68 С-30 сек
-1 per cycle
4, 72 С-45 сек
Повтор с 2 по 4-13 раз
5. 95 С- 30 сек
6, 65 С - 30 сек
7. 72 С-45 сек
повтор с 5 -20 раз
Конеч. элонгация 72 С-7 мин.

И второй протокол:
94°C for 5 min,
35 cycles of 95° C for 30 sec,
touchdown annealing from 65°C to 52°C for 30 sec
(1°C per cycle),
72°C for 45 sec and a final extension
at 72°C for 7 min.

Проблема в том, что выход амплификата получается либо у одной пробы (остальные без нужной полоски на электрофорезе), хотя я беру 100 % идущие пробы, либо амплификата нет вообще. Очень нуждаюсь в совете по необходимой подгонке микса для ПЦР и, возможно корректировке температурного режима. Премного благодарна за ответы.

Картинки:
IMG_20190415_151757.jpg - кликните, чтобы открыть увеличенную картинку
IMG_20190415_151757.jpg — (3.55мб)   

Участник оффлайн! semi
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 15.04.2019 23:56     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Праймеров слишком много, IMHO.
Если я не ошиблась в прикидках, то чуть ли не 10 раз больше, чем нужно.
И про Mg проверьте, не ли его в буфере.

Температуру отжига снизьте до 60 оС.

Маркер длин нужен при электрофорезе.

Праймеры у вас в двух местах отжигаются у козы, кстати; дают одинаковый продукт по длине. Дупликация там, что ли?

Сообщение было отредактировано semi - 16.04.2019 00:17
Участник оффлайн! Настя14145




 прочитанное сообщение 16.04.2019 10:17     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

(semi @ 16.04.2019 00:56)
Ссылка на исходное сообщение  Праймеров слишком много, IMHO.
Если я не ошиблась в прикидках, то чуть ли не 10 раз больше, чем нужно.
И про Mg проверьте, не ли его в буфере.

Температуру отжига снизьте до 60 оС.

Маркер длин нужен при электрофорезе.

Праймеры у вас в двух местах отжигаются у козы, кстати; дают одинаковый продукт по длине. Дупликация там, что ли?


Здравствуйте. Насчет шмеров, смею предположить, что я кладу слишком много ДНК-это не разведение, а матрица после выделения сразу (решила проверить, так как х10 кратное разведение ДНК не дает никакой реакции при данном протоколе). Насчет маркеров длин, да-виновата, не добавила (как правило, разумеется добавляю). Насчет магния в буфере уточню пожалуй у того, кто разводил (но не думаю, что он там присутствует). Премного благодарна Вам за ответы!
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 16.04.2019 10:26     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Не стыдно такой гель выкладывать? frown.gif
По тому что видно, ничего не скажу. И праймеров избыток на картинке, кстати, тоже не наблюдаю.
Шмеры от самих лунок - избыток геномки или результат "бешено -бестолковой" работы полимеразы.
И еще подозреваю что у Вас ДНК грязная и ее бУхаем в реакцию много, очень много. И конц-цию праймеров исправьте заодно... где Вы видели такие кг.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): banned sceptique-NMRguy
Участник оффлайн! Настя14145




 прочитанное сообщение 16.04.2019 10:36     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

(-Ъ- @ 16.04.2019 11:26)
Ссылка на исходное сообщение  Не стыдно такой гель выкладывать? frown.gif
По тому что видно, ничего не скажу. И праймеров избыток на картинке, кстати, тоже не наблюдаю.
Шмеры от самих лунок - избыток геномки или результат "бешено -бестолковой" работы полимеразы.
И еще подозреваю что у Вас ДНК грязная и ее бУхаем в реакцию много, очень много. И конц-цию праймеров исправьте заодно... где Вы видели такие кг.



Гель такой выкладывать стыдно, поэтому до последнего не обращалась сюда, пытаясь справиться самостоятельно. Поэтому и прошу помощи у Вас. Насчет геномики уже уяснила-исправлю этот момент. Насчет праймеров тоже поняла-пересчитаю. Благодарю за ответы.
Участник оффлайн! dk
Постоянный участник
Россия



 прочитанное сообщение 16.04.2019 10:58     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Какая длина продукта? Судя по протоколу около 0,5 kb - успевает ли пройти синтез: может, Вы пару kb "гоните"?
Праймеров - ну оооочень много. Вы, как я понимаю, льёте прямо готовый маточный р-р после разведения? На реакционную смесь, как у Вас, надо 1-0,5 мкл 10 mM
Температура гибридизации - Вы для чего используете "ступенчатую" ПЦР? Есть какое-то подозрение на неспецифику?
Довольно большая разница темп.гибр. между праймерами (55-50=5 градусов). Это не критично, но при высокой температуре второй праймер просто не успевает "прилипнуть". Уменьшите темп.гибр. до 48 градусов и посмотрите.
Для 25 мкл. ПЦР-смеси хватает и 1 ед. Taq-полимеразы, это реально "на кончике носика". Надеюсь, Вы готовите мастер-микс на много проб сразу, а не в каждую по отдельности? А то из 5-тысячной конц. запросто раз в 10 ошибётесь.
Магния, как мне кажется, слишком много (да и он, обычно, уже имеется в буфере). В конечной конц. не нужно больше 2,5 mM
Так что я бы, для начала, проверил все концентрации и уменьшил темп.гибр.
Участник оффлайн! Настя14145




 прочитанное сообщение 16.04.2019 11:29     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

(dk @ 16.04.2019 11:58)
Ссылка на исходное сообщение  Какая длина продукта? Судя по протоколу около 0,5 kb - успевает ли пройти синтез: может, Вы пару kb "гоните"?
Праймеров - ну оооочень много. Вы, как я понимаю, льёте прямо готовый маточный р-р после разведения?  На реакционную смесь, как у Вас, надо 1-0,5 мкл 10 mM
Температура гибридизации - Вы для чего используете "ступенчатую" ПЦР? Есть какое-то подозрение на неспецифику?
Довольно большая разница темп.гибр. между праймерами (55-50=5 градусов). Это не критично, но при высокой температуре второй праймер просто не успевает "прилипнуть". Уменьшите темп.гибр. до 48 градусов и посмотрите.
Для 25 мкл. ПЦР-смеси хватает и 1 ед. Taq-полимеразы, это реально "на кончике носика". Надеюсь, Вы готовите мастер-микс на много проб сразу, а не в каждую по отдельности? А то из 5-тысячной конц. запросто раз в 10 ошибётесь.
Магния, как мне кажется, слишком много (да и он, обычно, уже имеется в буфере). В конечной конц. не нужно больше 2,5 mM
Так что я бы, для начала, проверил все концентрации и уменьшил темп.гибр.


Премного благодарна Вам за ответы! Да, праймеры я действительно лью с маточного раствора, поэтому очень благодарна за данное замечание. Длина продукта 422 bp. с температурной подгонкой праймеров пробовала менять-получалось не очень успешно, но продукт хотя бы немного, но был. Мастер микс готовлю на планируемон для амплификации количество проб на один рабочий день, не раскапываю каждый реактив по пробиркам. Насчет магния-у нас буфер без него, собственно, поэтому и добавляю в смесь. Премного благодарна Вам за ответы-для меня эти замечания очень важны!
Участник оффлайн! semi
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 16.04.2019 13:23     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

(Настя14145 @ 16.04.2019 12:29)
Ссылка на исходное сообщение  ....Длина продукта 422 bp.

Не знаю, как вам удаётся что-то генотипировать, если ваши праймеры залипают в двух местах и дают продукт одинаковой длины? Это ведь у вас коза?

Да, и замечание про качество ДНК дельное. Чем выделяете ДНК?

Сообщение было отредактировано semi - 16.04.2019 13:25
Участник оффлайн! Настя14145




 прочитанное сообщение 16.04.2019 13:58     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

(semi @ 16.04.2019 14:23)
Ссылка на исходное сообщение  Не знаю, как вам удаётся что-то генотипировать, если ваши праймеры залипают в двух местах и дают продукт одинаковой длины? Это ведь у вас коза?

Да, и замечание про качество ДНК дельное. Чем выделяете ДНК?



Нет,это овцы. Выделяли наборам для выделения от Синтол (если я правильно помню-фенол хлороформ). Насчет генотипирования-предыдущие исследователи резали HaeIII и получали необходимые генотипы. С длинной расщепления 366 и 56 bp. Может я неправильно выразилась,но на фото результат амплификации до рестрикции.

Сообщение было отредактировано Настя14145 - 16.04.2019 14:00
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 16.04.2019 14:13     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

Полиморфизм гена гормона роста у баранов. Кстати, берут все из статьи, но очень старой, и делают все по старинке как в начале 90-х.
Все нормально, но чтобы дальше резать, ПЦР продукт должен быть практически идеальным без неспецифики (шмеров) и димеров. Но до этого очень далеко...
ПЦР реактивы тоже из Синтола?

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): kakakaka
Участник оффлайн! Настя14145




 прочитанное сообщение 16.04.2019 14:30     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

(-Ъ- @ 16.04.2019 15:13)
Ссылка на исходное сообщение  Полиморфизм гена гормона роста у баранов. Кстати, берут все из статьи, но очень старой, и делают все по старинке как в начале 90-х.
Все нормально, но чтобы дальше резать, ПЦР продукт должен быть практически идеальным без неспецифики (шмеров) и димеров. Но до этого очень далеко...
ПЦР реактивы тоже из Синтола?


Нет, большая часть берется из Сибензима, праймеры из Еврогена.
Участник оффлайн! semi
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 16.04.2019 14:36     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

(kakakaka @ 16.04.2019 15:32)
Ссылка на исходное сообщение  знакычь ттото я акуеваю что праймеры на гин7ом коровы ни лажатся  eek.gif  confused.gif

Зато на козу легло, как влитое.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): kakakaka
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 16.04.2019 14:48     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

Вам остается попробовать ПЦР реактивы от другого производителя. Других советов чтобы Вы смогли "корректировать и калибровать параметры ПЦР" у меня лично нет.
ПЦР у Вас не идет, контролей нет никаких, т.е. говорить не о чем, к сожалению.
Участник оффлайн! Настя14145




 прочитанное сообщение 16.04.2019 14:49     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

(-Ъ- @ 16.04.2019 15:48)
Ссылка на исходное сообщение  Вам остается попробовать ПЦР реактивы от другого производителя. Других советов чтобы Вы смогли "корректировать и калибровать параметры ПЦР" у меня лично нет.
ПЦР у Вас не идет, контролей нет никаких, т.е. говорить не о чем, к сожалению.


Я Вас поняла. Премного благодарна за ответы и советы. С уважением.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 16.04.2019 14:50     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

(kakakaka @ 16.04.2019 15:41)
Ссылка на исходное сообщение  сема извини топикстартер сказала что корова  eek.gif  confused.gif

нет, сказала МЕЛКИЙ, а не КРУПНЫЙ но рогатый скот. tongue.gif
Участник оффлайн! kb1
Участник



 прочитанное сообщение 18.04.2019 00:56     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

попробуйте режим
94 С - 20 сек
58 С -20 сек
70 С - 20 сек

магний до 2 мМ
Участник оффлайн! Настя14145




 прочитанное сообщение 18.04.2019 11:05     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

(kb1 @ 18.04.2019 01:56)
Ссылка на исходное сообщение  попробуйте режим
94 С - 20 сек
58 С -20 сек
70 С - 20 сек

магний до 2 мМ



Добрый день. Хорошо, попробую, спасибо за совет!
Участник оффлайн! semi
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 18.04.2019 11:19     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

(Настя14145 @ 18.04.2019 12:05)
Ссылка на исходное сообщение  Добрый день. Хорошо, попробую, спасибо за совет!

А что-нибудь уже пробовали из множества советов бывалых?
Участник оффлайн! Настя14145




 прочитанное сообщение 18.04.2019 11:25     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

(semi @ 18.04.2019 12:19)
Ссылка на исходное сообщение  А что-нибудь уже пробовали из множества советов бывалых?


Да, развела праймеры, снизила концентрацию магния и ДНК взяла в разведении и снизила количество Taq. Также попробовала снизить температуру отжига до 52 и 48, и убрала градиент. При 52 проявились еле заметные бэнды на нужной длине, на 48, к сожалению, ничего.

Сообщение было отредактировано Настя14145 - 18.04.2019 11:26
Участник оффлайн! semi
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 18.04.2019 14:53     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

(Настя14145 @ 18.04.2019 12:25)
Ссылка на исходное сообщение  Да, развела праймеры, снизила концентрацию магния и ДНК взяла в разведении и снизила количество Taq. Также попробовала снизить температуру отжига до 52 и 48, и убрала градиент. При 52 проявились еле заметные бэнды на нужной длине, на 48, к сожалению, ничего.

Ну значит, вы на правильном пути.
Поднимите температуру до 58, как выше советуют.
Шмер-то исчез? Или вы после здешней ругани нам картинок больше не предъявите?

Сообщение было отредактировано semi - 18.04.2019 14:54
Участник оффлайн! Настя14145




 прочитанное сообщение 18.04.2019 14:55     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

(semi @ 18.04.2019 15:53)
Ссылка на исходное сообщение  Ну значит, вы на правильном пути.
Поднимите температуру до 58, как выше советуют.
Шмер-то исчез? Или вы после здешней ругани нам картинок больше не предъявите?



Уже в работе. Шмеров почти не было, Пока идет амплификация, после фореза покажу фото. Премного благодарна за поддержку!

Сообщение было отредактировано Настя14145 - 18.04.2019 14:56

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 17.07.19 19:00
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft