molbiol.ru -> Очистка His6-меченного белка на Ni-NTA колонке

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Очистка His6-меченного белка на Ni-NTA колонке -- comments to a permanent page of the site --

Тема связана с: His6-меченные белки
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

Forum robot
Постоянный участник
на сервере в Москве

22.08.2005 22:55

URL #1

Экспрессия и очистка полигистидин меченных белков. Приготовление стоковой культуры. Препаративная культура. Приготовление осветлённого лизата. Определение ёмкости Ni-NTA агарозы. Препаративная очистка (элюция имидазолом; элюция кислым буфером). Регенерация Ni-NTA агарозы.

Nameless
Постоянный участник
CA

22.08.2005 22:55

URL #2

BCA protein assay вообще довольно чувствителен к имидазолу (для micro допускается 12.5 мМ, macro - 50 mM). У меня например белки снимаются в основном 250 мМ имидазолом, т.е. в микро-модификации разведение 1:10 уже не катит, а 1:20 - на пределе допустимой концентрации. Советую для белков в имидазоле использовать BioRad Protein assay kit.

Поблагодарили (2): Fedo, bio-1985

Fedo
Постоянный участник
Nemetchina

24.08.2005 00:48

URL #3

Spasibo tebe Nameless. Kak raz predstoit skoro chistit' belok s 6His... A v labe toka BCA protein assay. Budem vybivat' BioRadovskij Kit ))

Nameless
Постоянный участник
CA

24.08.2005 17:29

URL #4

Нет, вообще конечно можно и тем пользоваться, но надо чтобы имидазол в пробах был меньше 12.5 мМ или чтобы белка было очень много и мерять его макроБСА. У меня белка было немного и снимал я его в 250 мМ, поэтому и не получалось.

Nameless
Постоянный участник
CA

24.08.2005 18:50

URL #5

Да, кстати о птичках. Тут на днях наши звонили в Biorad и получили информацию что пластиковые эппендорфы при нагревании до 60 градусов (как это рекомендуется в ВСА assay) выделяют вещество которое поглощает как раз в том диапазоне волн в котором рекомендуется проводить измерения (562). Так что НА САМОМ ДЕЛЕ они рекомендуют или ставить при 37 в пластике или при 60 но в стеклянных пробирках. Вот такие пироги.
Так что если у кого результаты не сходятся - звоните в биорад, получайте ответ - и бегом к шефу

Guest
IP-штамп: frlkSmZr37YvE
гость

24.08.2005 19:17

URL #6

так там калибровка делается в тех же условиях, так что весчество везде выделяется - и в опыте и в контрольных образцах

Nameless
Постоянный участник
CA

25.08.2005 21:07

URL #7

Оно то понятно, но ведь хрен же его знает, как на него повлияет наличие вашего белка и компонентов буфера в котором он растворён.

_enisseisk_
IP-штамп: frftLGqhpFF.A
гость

11.01.2006 03:57

URL #8

1. вообще-то все то же самое можно делать и в денатурирующих условиях - см. напр., протокол(ы) на <a href="http://www.qiagen.com." target="_blank">www.qiagen.com.[/url] Это может быть полезным в случае, когда белок плохо растворимый, подвергается агрегации итп. Выходы при этом - выше, а белок можно потом диализовать, если нужно.
2. с нативной очисткой - тоже должно все работать, но можно при лизисе (озвучивание во льду) добавлять еще и ингибиторы протеаз, например, ФМСФ до 100 мкМ. Остальные - дело вкуса.
3. тип сорбента - тоже может иметь значение. Qiagen-овские неплохи, но и от Sigma (Ni-CAM HC) ничего. И для FPLC годится.

serhiosus
Участник
Minsk

05.05.2007 15:18

URL #9

Вопрос. Насколько я понимаю, глюкоза не мешает индукции с помощью IPTG (сам индуцирую 0,5 мМ IPTG при наличии в среде 0,5% глюкозы). Зачем тогда уксложнять процедуру индукции за счет отмывки клеток?

Esya
Постоянный участник
PA, USA

06.05.2007 23:48

URL #10

(Nameless @ 24.08.2005 15:29)

Ага, если белок кумассей красится, то бредфорд завсегда лучше, не надо забывать, что мелочь всякая зачастую плевать на биорадовскую краску в кислоте хотела. А БСА он без претензий, все меряет и даже альбумин можно в качестве стандарта часто использовать.

Гость
IP-штамп: fr3h//j.zHZU.
гость

08.05.2007 10:56

URL #11

Подскажите пожалуйста при работе с Ni-NTA колонкой можно ли использовать ДТТ или β-меркаптоэтанол

Tom1
Постоянный участник

08.05.2007 13:33

URL #12

НЕТ

Kaa-g
Участник

08.05.2007 14:15

URL #13

А по-моему β-меркаптоэтанол можна, у меня лизис буфер с β-меркаптоэтанол и белок выделяется и колонку использовал несколько раз лаж небыло еще, а вот ДТТ однозначно нельзя.

Гость
IP-штамп: fr3h//j.zHZU.
гость

08.05.2007 14:40

URL #14

А почему, что там происходит??
Дело в том, что хроматография на Ni-NTA прошла с ДТТ и все поделилось и почистилось, но только в процессе работы колонка из зеленовато голубой превратилась в бурокоричневую, но потом при отмывке имидазолом, эта бурая окраска сошла с белком и теперь препарат белка светлокоричневый. А колонка опять нормального цвета.
Разница между βмэ и ДТТ только в дополнительных SH и ОН группах следовательно и реакция ионов никеля будет с ними одинаковой???
А как же работают на Ni-NTA с белками, которым нужны ДТТ и βмэ???

Tom1
Постоянный участник

08.05.2007 15:42

URL #15

меняют ДТТ и мео на цистеин....

Esya
Постоянный участник
PA, USA

08.05.2007 16:03

URL #16

мео можно аж до 20 мМ - иногда размер, то есть число групп, важен

ДТТ - хелатор, а МЭО - нет

Еще можно TCEP - пользовать

Это если никелевый сорбент пользовать, кобальтовый и МЕО плохо переносит по другим причинам. Читайте инструкцию.

Сообщение было отредактировано Esya - 08.05.2007 16:05

bio-1985

05.09.2007 17:02

URL #17

Привет всем. Подскажите, пожалуйста, методики выделения His6-меченного белка в денатурируюдщих условиях. Кто встречался с деградацией белка из-за протеаз при хранении и очистке? Как с этим боролись? Какие ингибиторы, кроме PMSF и леупептина, использовали?

Гость
IP-штамп: frsCQkPH3djzA
гость

09.01.2008 19:29

URL #18

"Привет всем. Подскажите, пожалуйста, методики выделения His6-меченного белка в денатурируюдщих условиях. Кто встречался с деградацией белка из-за протеаз при хранении и очистке? Как с этим боролись? Какие ингибиторы, кроме PMSF и леупептина, использовали?"

посмотрите на 23 стр этого протокола:

http://www.emdbiosciences.com/docs/docs/PROT/TB273.pdf

Гость
IP-штамп: frsCQkPH3djzA
гость

09.01.2008 19:35

URL #19

"Кто встречался с деградацией белка из-за протеаз при хранении и очистке? Как с этим боролись?"

EDTA 1mM
EGTA 0.5mM
20% glycelol, можно до 50% glycerol (тогда колонку после нанесения элюирующего буфера лучше центрифугировать).

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

09.01.2008 22:43

URL #20

Дык есть коктейли из ингибиторов. Но ..., Что еще? Температуру пониже все делать на 0-4С, для хранения белок лиофилизовать хранить на -70 в двойной герметичной таре, в наружной таре держать активированный селикагель.

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.