Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Ответ в need help with PCR

Иконка сообщения*  [ Без иконки ]   Важно!   Вопрос   Информация     Обмен опытом   Шутка, забавная история     Поздравления, благодарности   Возмутительно!   Проблема   Картинки, фотографии
Введите имя

 [вст. закрывающие теги*

*


*



Смайлик: согласен Смайлик: не согласен Смайлик: улыбка Смайлик: пожалуйста, умоляю! Смайлик: помираю со смеху Смайлик: подмигивание Смайлик: подшучивать, дразнить Смайлик: смущение Смайлик: мне стыдно Смайлик: жуть! Смайлик: не понял Смайлик: закатывать глаза Смайлик: недовольство, огорчение Смайлик: рёв в три ручья Смайлик: злость Смайлик: супер Смайлик: умник Смайлик: чайник Смайлик: сходка Смайлик: Ура! Смайлик: не получается!
Перевод выделенного текста из латиницы в кирилицу. Текст в квадратных скобках '[]' не преобразуется

Пример: biologija -> биология [b] - полужирный шрифт

Пример: [b]полужирный[/b] [i] - курсив

Пример: [i]курсив[/i] [u] - подчёркнутый

Пример: [u]подчёркнутый[/u] [sup] - верхний индекс

Пример: температура 37[sup]o[/sup]C [sub] - нижний индекс

Пример: H[sub]2[/sub]O - вода [QUOTE] - применяется для цитирования чужих сообщений, цитата вставляется с небольшим отступом от края текста

Пример: [QUOTE]цитата[/QUOTE] [code] - форматирование как при вводе
Применяется для вывода теста как он есть, с предотвращением форматирования (автопереноса на новую строку), без интерпретации кодов форума и смайликов; вставляется с небольшим отступом от края текста.

Пример: 
[code]
программный код
	1 строка
	2 строка
[/code] [list] - список:
возможны опции: 1, a, A, i, I
[list] неупорядоченный; 
[list=1] нумерованный; 
[list=A] упорядоченный по буквам A-Z

Пример:
[list=1]
[*] первая строка;
[*] вторая строка;
[/list] Тег [hr] - горизонтальная разделительная линия

Пример: 
Абзац 1
[hr]
Абзац 2 [url] - гиперссылка

Примеры:
[url]www.ncbi.nlm.nih.gov[/url]
[url=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/]NCBI[/url] [email] - ссылка на адрес электронной почты

Пример: [email]masha@mail.ru[/email] Тег [img] - рисунок
[img] - в строке;
[imgL] - выравнивание по левому краю; 
[imgR] - выравнивание по правому краю.

Пример:
[img]http://molbiol.ru/izo/rl.gif[/img] [ru] - только для русских читателей

Пример:
[ru]это увидят только те, кто использует русский интерфейс[/ru] [en] - только для английских читателей

Пример:
[en]это увидят только те, кто использует английский интерфейс[/en] [self] - текст виден только вам и администрации

Пример:
[self]это увидите только вы сами[/self]
[left] - выравнивание по левому краю

Пример: [left]текст слева[/left] [center] - выравнивание по центру

Пример: [center]текст в центре[/center] [right] - выравнивание по правому краю

Пример: [right]текст справа[/right] [just] - выравнивание по обоим краям

Пример: [just]выровненный текст[/just]

     размер сообщения / макс. размер:  / 15360


Последние 10 сообщений [ в обратном порядке ]
kenseq Отправлен 14.07.2019 20:39
 
(ship @ 09.07.2019 13:49)
Ссылка на исходное сообщение  А вы можете для начала описать конечную цель того, что Вы делаете и что хотите получить?

smile.gif beer.gif beer.gif
шип я пцрил такие оверханги толко на микробиом 16S Illumina MiSeq smile.gif
ship Отправлен 09.07.2019 12:49
 
(shinavn @ 20.06.2019 03:02)
Ссылка на исходное сообщение  Здравствуйте,

но может кто-нибудь подскажет альтернативный вариант?

А вы можете для начала описать конечную цель того, что Вы делаете и что хотите получить?
kenseq Отправлен 09.07.2019 00:27
  выложите ваш куев праймер smile.gif
kenseq Отправлен 09.07.2019 00:21
 
(shinavn @ 20.06.2019 06:02)
Ссылка на исходное сообщение  
Вторичные структуры для праймеров образуются при температурах ниже 55, и не закрывают часть комплементарную ДНК


вот тут поподробней про вторичные структуры lol.gif lol.gif beer.gif beer.gif jump.gif jump.gif jump.gif
tipisev Отправлен 21.06.2019 22:29
 
(-Ъ- @ 20.06.2019 20:37)
Ссылка на исходное сообщение  Отжиг наоборот повышайте сколько еще позволяют 20 нт, но самое главное надо повысить ВРЕМЯ на отжиге в два-три раза (до минуты) на первых 4-5 циклах.
А далее по программе 72-95 град. делайте то же количество циклов, что было с "нормальными" праймерами. Все должно быть ОК, по своему опыту.

umnik.gif beer.gif

60 оверханг Иллумина шоли lol.gif lol.gif

  наскока помню 60 бп оверханг это 16с микробиом на иллумине  eek.gif  confused.gif  eek.gif  confused.gif
сделай короткий оверханг на основной пцр потом добав 3 цикла 60 бп

ваамсчето делал лимон раз 60 нт оверханги Проблем небыло eek.gif confused.gif
-Ъ- Отправлен 20.06.2019 19:37
  Отжиг наоборот повышайте сколько еще позволяют 20 нт, но самое главное надо повысить ВРЕМЯ на отжиге в два-три раза (до минуты) на первых 4-5 циклах.
А далее по программе 72-95 град. делайте то же количество циклов, что было с "нормальными" праймерами. Все должно быть ОК, по своему опыту.
Carbon Copy Отправлен 20.06.2019 16:05
  Я думаю, что ПЦР у Вас идёт с очень низкой эффективностью и поэтому Вы не видите фрагментов, так как их мало. Проще всего будет ничего не менять, а поставить вторичную ПЦР с праймерами, комплиментарными к овехэнгам.
Asterix Отправлен 20.06.2019 14:34
  Ну в принципе правильно сказали , берете свой ПЦР продукт с короткими праймерами в качестве матрицы и на нем уже ПЦРите с длинными. И все будет ...

Ну а напрямую с геномки тоже можно , ничего особо страшного в этом нет , надо просто добавить ДМСО , 5% скажем... и взять другую полимеразу, ну и хотстарт обязательно.

делайте 54-72-94, и не мучайтесь с подбором температуры отжига , это самое последнее о чем надо думать.

Ну и я так понимаю новые праймеры вам не хочется делать , но на будущее в такой ситуации минимум 25 нуклеотидов делайте комплиментарную матртице область. А лучше все 30. Это сгладит кучу возможных осложнений в реакции
MMM Отправлен 20.06.2019 06:47
  Интересно, вы сами такой изврат придумали или вам кто-то посоветовал. Не получицца!!!!

Не очень понятно зачем и к чему такие "адаптеры" длинные.

Альтернативы я вижу две.

Первая
Вы делаете несколько последовательных ПЦР с серией праймеров длиной не более 30 . Каждый раз последовательность праймеров должна смещаться все дальше по последовательности адаптера и при этом иметь в составе однонитевое продолжение последовательности.

Вторая
Вы делаете ПЦР с нормальными праймерами, с которыми она у вас идёт. Потом для порядку чистите полученный фрагмент электрофорезом.

И далее делаете как бы один цикл с длинными адаптерами. Т. е. Денатурируете фрагмент, добавляете длинные праймеры("адаптеры") и отжигаете при низкой температуре (градусов 40 , минут 15-20) затем добавляете полимеразу и нуклеотиды и достраиваете фрагмент при 72 градусах тоже минут 5-10. Эту историю проще вообще делать не в циклере, а в простом термостате.
Потом берете из этой пробирки небольшую аликвоту и с ней делаете ПЦР с короткими праймерами к концевым последовательностям "адаптеров"
shinavn Отправлен 20.06.2019 05:02
  Здравствуйте,

Я пытаюсь оптимизировать ПЦР с праймерами, у которых комплементарный участок 20 бп и оверханг 60 ("адаптер"). Без адаптеров ПЦР работает прекрасно, нет неспецифики на геномке. Когда я пытаюсь повторить то же самое но с длинными праймерами ПЦР не идет совсемfrown.gif Праймеры остаются неизрасходованными (сингл-странд), ПЦР продукта они не образуют. Я попыталась снизить температуру отжига с 60 до 55, еффект тот же. И попробовала первые 4 цицла на 55 и оставшиеся на 72 (Тм праймера с адаптером 78), не помогло.
Вторичные структуры для праймеров образуются при температурах ниже 55, и не закрывают часть комплементарную ДНК.

но может кто-нибудь подскажет альтернативный вариант?
Посмотреть тему (откроется в новом окне)

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 19.08.19 05:27
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft