Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Не стабильность результата ПЦР -- "Левые" пики на кривых плавления --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Coloney




 прочитанное сообщение 01.11.2017 11:31     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Здравствуйте товарищи. Подскажите пожалуйста кто-нибудь сталкивался с таким явлением, что на кривых плавления в результате появляется "левый пик". Я так и не понял с чем это может быть связано. Не понятный пик на 2 картинке (ogur2), на 3 картинке (ogur1) этот же планшет сделанный повторно, буфер, программа и ДНК одинаковые, но все же не понятный подъем на 74 градусах, идеальная картинка должна быть как на 1 картинке (ogur3). Объясните кто может, что пошло не так?

Картинки:
картинка: ogur3.jpg
ogur3.jpg — (79.63к)   

картинка: ogur2.jpg
ogur2.jpg — (96.83к)   

картинка: ogur1.jpg
ogur1.jpg — (75.21к)   

Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 01.11.2017 11:53     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

праймер-димеры побеждают матрицы в ПЦР. градиентником просканируйте температуры отжига.
Участник оффлайн! LMP
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 01.11.2017 11:55     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Похоже на неспецифику. То, что у вас реагенты везде одинаковые имело бы значение лишь в том случае, если бы вам плашку капал робот. С другой стороны, может быть неравномерный прогрев плашки? Краевые лунки от центральных отличаются?
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 01.11.2017 11:57     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Условия реакции все же изменились, что привело к сильной димеризации праймеров и блокировке синтеза PCR продукта.
Могли ошибиться с концентрацией магния в сторону увеличения до 4-6 мМ, например?.
Участник оффлайн! Horse-radish
Участник



 прочитанное сообщение 01.11.2017 12:00     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Классическое проявление димеров-праймеров. Прислушайтесь к совету ksm, и/или в 1,5-2 раза уменьшите конц-ии праймеров.

зы: 2я картинка как то плохо выглядит, лучше выбрать новые праймеры.

Сообщение было отредактировано Horse-radish - 01.11.2017 12:02
Участник оффлайн! Coloney




 прочитанное сообщение 01.11.2017 12:31     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

(LMP @ 01.11.2017 12:55)
Ссылка на исходное сообщение  Похоже на неспецифику. То, что у вас реагенты везде одинаковые имело бы значение лишь в том случае, если бы вам плашку капал робот. С другой стороны, может быть неравномерный прогрев плашки? Краевые лунки от центральных отличаются?


Нет, крайние лунки от центральных не отличаются, плашка прогревается равномерно
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 01.11.2017 12:35     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

Ребята, да нет же, повнимательнее почитайте вопрос ТС и к тому же дана в качестве "контроля" идеальная, на мой взгляд, картинка. Все ОК, но не постоянно - сегодня хорошо, а на следующий день - одни димеры. Ничего не меняет.
Coloney, пишите в деталях как раскапываете.
Участник оффлайн! Coloney




 прочитанное сообщение 01.11.2017 12:35     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

(-Ъ- @ 01.11.2017 12:57)
Ссылка на исходное сообщение  Условия реакции все же изменились, что привело к сильной димеризации праймеров и блокировке синтеза PCR продукта.
Могли ошибиться с концентрацией магния в сторону увеличения до 4-6 мМ, например?.


концетрация магния надеюсь постоянная, потому что ипользуется буфер от Thermo Scientific содержащий магний
Участник оффлайн! LMP
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 01.11.2017 12:37     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

(-Ъ- @ 01.11.2017 09:57)
Ссылка на исходное сообщение  Условия реакции все же изменились,
Мож мастермикс как-то не так хранили?...
Участник оффлайн! Coloney




 прочитанное сообщение 01.11.2017 12:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

(-Ъ- @ 01.11.2017 13:35)
Ссылка на исходное сообщение  Ребята, да нет же, повнимательнее почитайте вопрос ТС и к тому же дана в качестве "контроля" идеальная, на мой взгляд, картинка. Все ОК, но не постоянно - сегодня хорошо, а на следующий день - одни димеры. Ничего не меняет.
Coloney, пишите в деталях как раскапываете.


В деталях готовиться буфер для реакции на 500 мкрл, раскапывается с помощью степпера от eppendorf по 5 мкрл в 96-луночный планшет, после этого добавляется днк дозатором на 5 мкрл, итого получается около 10 мкрл смеси в каждой лунке, заклеил пленкой и в "печь". Протокол для реакции ставится постоянно одинаковый.
Вот идея с концентрацией хорошая, праймеры новые пришли, хоть и разбавлены по инструкции производителя, проведу реакцию с уменьшенной концентрацией и отпишу
Участник оффлайн! LMOG




 прочитанное сообщение 01.11.2017 13:00     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

10 мкл не лучший объем реакции. будет бОльшая вариабельнось результатов при раскапывании и тп.
нанесите образцы на гель и посмотрите размеры полос.
днк какая и в какой концентрации берется? и что вообще ПЦРится?
судя по каринкам у вас не только димеры, но и сами продукты вариабельного размера (каринка 3)
Участник оффлайн! Coloney




 прочитанное сообщение 01.11.2017 13:30     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

(LMOG @ 01.11.2017 14:00)
Ссылка на исходное сообщение  10 мкл не лучший объем реакции. будет бОльшая вариабельнось результатов при раскапывании и тп.
нанесите образцы на гель и посмотрите размеры полос.
днк какая и в какой концентрации берется? и что вообще ПЦРится?
судя по каринкам у вас не только димеры, но и сами продукты вариабельного размера (каринка 3)


Какой объем реакции будет стабильнее? 8 мкрл?
Реакция ставится на растениях, действительно вариабельность есть, концентрация ДНК не одинаковая но в определенных пределах 200-600 нм, в среднем 300-350 нм если верить прибору Simpli nano
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 01.11.2017 14:45     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

В реакцию вносится ДНК от разных образцов без выравнивания концентраций?
Как выделяете ДНК (метод, кит), какая "печь" у Вас в работе, а какие пленки используете для запечатывания плашек?
Разная ДНК по чистоте и количеству (что такое 200-600 нм ???), конденсат на стенках пробирок к концу реакции, испарение из-за плохого контакта пленки - основные причины появления димеров и как следствие подавления основной реакции.
Перед "печкой" плашки положено фуговать для сброса капелек на дно.
л,л,л, мл,мл,мл, мкл,мкл,мкл. yes.gif
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 01.11.2017 15:00     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

(Coloney @ 01.11.2017 11:30)
Ссылка на исходное сообщение  Какой объем реакции будет стабильнее? 8 мкрл?
Реакция ставится на растениях, действительно вариабельность есть, концентрация ДНК не одинаковая но в определенных пределах 200-600 нм, в среднем 300-350 нм если верить прибору Simpli nano

20 мкл или 25 мкл.
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 02.11.2017 06:37     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

Буфер полностью размораживаете? Иногда там осадок может быть, так вот его надо каждый раз полностью растворять.
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  20.11.2021 18:26     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

https://wanelo.co/replicarolexwatches
https://musescore.com/fakerolexwatches
https://www.racked.com/users/Replicarolexwatches
https://sketchfab.com/Rolexrelicawatches
http://www.video-bookmark.com/bookmark/433...eplica-watches/
https://www.slideserve.com/ReplicawatchesUK...pt-presentation
https://www.theverge.com/users/Replicarolexwatches
https://www.yumpu.com/en/document/read/6532...lica-watches-uk
https://online.flippingbook.com/view/152275247/
https://www.instapaper.com/p/8767342
https://www.bigblueview.com/users/Replicarolexwatches
https://weheartit.com/watcheshutuk
https://sites.google.com/view/replicarolexwatches24/home
https://www.indiehackers.com/post/hints-on-...atch-113aef73a9
http://replicawatchesuk.esportsify.com/for...ica-rolex-watch

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 28.03.24 09:17
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft