molbiol.ru -> Артефакты на форезе и блоте.

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Артефакты на форезе и блоте. -- В чем причина? --

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

Panaev
Постоянный участник

27.06.2014 09:09

URL #1

На форезе появляются вертикальные тяжи (1).
картинка: 1.jpg

На блоте они выявляются еще ярче, естественно (2).
картинка: 2.jpg

Иногда на блоте вообще превращаются в непотребное что-то (3).
картинка: 3.jpg

В чем может быть причина? Может гель к стеклу плохо прилегает?

Sky7walker
Участник

27.06.2014 09:36

URL #2

Плохо отДНКазили образец. Можно улучшить ситуацию увеличив длительность нагревания в буфере для нанесения.

Panaev
Постоянный участник

27.06.2014 10:08

URL #3

Вообще не ДНКазили. Это белковый форез. Белки плазмы крови человека.

R.J.Dio
Постоянный участник

27.06.2014 11:13

URL #4

солевые эффекты

Alex2006
Постоянный участник
Берлин

27.06.2014 12:08

URL #5

хорошо открутите пробы перед нанесением. Надосадок аккуратно отобрать и можно еще раз прокипятить.
второй блот (непотребный) конкретно перегружен материалом - разведите раз в 100.

dk
Постоянный участник
Россия

27.06.2014 13:17

URL #6

На нижней картинке пробы явно "перебухали". С белками не всегда "чем больше - тем лучше". А подобные "наплывы" у меня были на жирном материале (когда в супернатанте сверху аж липидная капля болталась). Попробуйте Тритоном пробы обработать (если это нативный форез). Когда гель от стела отстаёт там получается некий общий фронт, который и красится соотвественно везде. У Вас же наоборот "тяжи" непрокрашиваются.

Tuco Ramires
Постоянный участник
Rio Grande

27.06.2014 13:30

URL #7

А какая пробоподготовка? Плазма + сэмпл и прогрев, или есть нюансы?

guest: ммм
IP-штамп: fre/rrUGoIiqA
гость

29.06.2014 09:09

URL #8

Обычно такие тяжи образуются из-за наличия коллоидных частичек белка в пробе и(или) из-за их образования в процессе ЭФ. Причин много практически все уже перечислили выше.
1) Перегруз - высокая концентрация белка в пробе
2)Неполное растворение пробы при пробоподготовке(открутить)
3)Высокая концентрация солей в пробе

так же похожие эффекты могут возникать из-за микропузырей между концентрирующим и разделяющим гелем.

Alex2006
Постоянный участник
Берлин

30.06.2014 13:55

URL #9

насчет борьбы с пузырями на границе концентрирующего и разделяющего...
Не давайте верхнему гелю пересохнуть и прилипнуть гребенке, чтобы при вытаскивании этих пузырей не образовалось.

Panaev
Постоянный участник

03.09.2014 09:33

URL #10

(Tuco Ramires @ 27.06.2014 14:30)

А какая пробоподготовка? Плазма + сэмпл и прогрев, или есть нюансы?

Да. Только не цельная плазма, а продукты фракционирования.

Алексей Соколов
Постоянный участник
Санкт-Петербург

03.09.2014 16:34

URL #11

Попробуете использовать повыше концентрацию Tris-буфера в разделяющем геле и добавьте в оба геля сахарозу (10, а лучше 15%). Мы заметили сильные отличия по сравнению со стандартным протоколом Laemmli: зоны были гораздо уже, вместо широких пятен на Вестерн-блоттинге были узкие полоски, даже при изучении образцов цельной сыворотки. По сути вам нужно просто взять в два раза больше трисового-буфера при приготовлении разделяющего геля и добавить в него сахарозу. Кратко метод: Для разделения белков с большим разрешением использовали электрофорез в ПААГ с 750 мМ Tris-HCl буфером, рН 8,9 [Fling and Gregerson, 1986]. В качестве концентрирующего геля использовали 5%-ный ПААГ, содержащий 125 мМ Tris-HCl буфер рН 6,8. В гель добавляли 15% сахарозы (стоковый раствор 60%) и SDS до 0,1%. Для полимеризации в смесь буфера и акриламида (стоковый раствор 48% акриламида, соотношение акриламид/метиленбисакриламид=30/0,8) добавляли ТЕМЕД до 0,1% и 25%-ный персульфат аммония до конечной концентрации 0,1%.
Fling, S.P., Gregerson, D.S. Peptide and protein molecular weigth determination by electrophoresis using a high-molarity tris buffer system without urea. // Anal. Biochem. 1986. V. 155. P. 83-88.
Сколько мкг белка вы наносите в лунки геля?

Panaev
Постоянный участник

04.09.2014 04:50

URL #12

Спасибо.
В зависимости от вида проб 10-40 мкг тотального белка.

watchesbiz
Постоянный участник

27.11.2021 07:19

URL #13

http://www.authorstream.com/Replicawatches24/
https://about.me/Replicawatches24
https://moz.com/community/users/17050093
https://trello.com/rolexrelicawatches/activity
https://replicarolexwatches.dreamwidth.org/365.html
https://visual.ly/users/watcheshutuk/portfolio
https://www.viki.com/users/watcheshutuk_549/about
https://www.academia.edu/s/14bdb7d4fe?source=link
https://www.slideshare.net/Nowseore/guide-o...ex-watch-online
https://audiomack.com/rolexrelicawatches
https://soundcloud.com/replicarolexwatches
https://www.bagtheweb.com/u/fakerolexwatches/profile
https://www.flipsnack.com/ReplicawatchesUK/...ca-watches.html
https://www.4shared.com/office/zA4L7Rmzea/G...hase_a_Fak.html?
https://codepen.io/Rolexrelicawatches/full/abBEzaQ

watchesbiz
Постоянный участник

27.11.2021 07:19

URL #14

watchesbiz
Постоянный участник

27.11.2021 07:24

URL #15

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.