molbiol.ru -> PAAG электрофорез белков

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* PAAG электрофорез белков -- comments to a permanent page of the site --

Тема связана с: SDS PAAG
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

страницы (9): « < 2 3 4 5 6 > »

Cruel
Участник
~

15.05.2008 16:34

URL #151

А нужно ли подвергать воздействию 95С 5мин образец, денатурированный в 8М мочевины? Т.е. получается, что денатурация в этом случае проходит дважды?

bukach
Постоянный участник
Geneva, Switzerland

16.05.2008 00:43

URL #152

(Cruel @ 15.05.2008 16:34)

не то что бы не нужно, но нежелательно. но не из-за "дважды денатурации", а карбамоилирования и пр.

Cruel
Участник
~

19.05.2008 13:35

URL #153

не то что бы не нужно, но нежелательно. но не из-за "дважды денатурации", а карбамоилирования и пр.

тогда я могу эти образцы смешивать с 5хsds-page sample buf. и наносить? т.е. получается, что белки побегут в обычном белковом геле? я имею ввиду, что в геле нет мочевины и пр.

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

19.05.2008 18:00

URL #154

-- нужно ли подвергать воздействию 95С 5мин образец, денатурированный в 8М мочевины? Т.е. получается, что денатурация в этом случае проходит дважды?

Если хотите восстановить S-S связи, то придется. Или ждать пока они востановятся сутки, другие.

Несмотря на
--"карбамоилирования и пр."

Я бы кипятиил в SDS, а потом сыпал бы сухую мочевину, до нужной концентрации.

-тогда я могу эти образцы смешивать с 5хsds-page sample buf. и наносить?

Ага, у вас образцы по ходу, до анализа в мочевине.
Ага, меня всегда весилил 5х буфер растворимый только при 60 градусах.
Можете добавить SDS чуть-чуть(0.1-0.2%) и глицерина для плотности. Не нужен вам там ведерный SDS. Просто в 8М мочевине SDS с белками практически не вяжется и его присутствие в пробе, по большому счету ничего не решает.

-- т.е. получается, что белки побегут в обычном белковом геле? я имею ввиду, что в геле нет мочевины и пр.

Если в геле будет мочевина, то это уже не будет Лэмли форез. SDS не будет связываться с белками и они будут делится не по массе, а по массе и заряду. К тому же щелочные белки вообще не войдут в гель при таком раскладе. Возможны и более размытые зоны.

У вас мочевина останется в кармане. А белочек будет входить в гель без нее. Если SDS-а не хватит, что бы растворить белок(а SDS из пробы и ЭБ будет сквозь мочевину со свистом пролетать) при вхождении в гель будут осадки(шлейфы от кармана по гелю в концентрирующем и начале разделяющего геля). С другой стороны очень много SDS в геле и в ЭБ будут рождать артефакты. Так что если будут осадки, то можно просто повысить концентрацию SDS в пробе. Возникновение осадков зависит от концентрации белка в пробе и от его личной вредности агрегировать из денатурированного состояния.

Cruel
Участник
~

20.05.2008 11:29

URL #155

Здрасте ВСЕ!!!

Спешу поблагодарить ответивших на мои предыдущие посты - спасибо ребята!

теперь вот,

состав моих:

30% acrylamide/0,8 bis-acrylamide;

2.5x separating gel buffer: 1.875 M Tris·Cl, 0.25% SDS pH 8.9;

5x stacking gel buffer: 0.3 M Tris·phosphate, 0.5% SDS pH 6.7;

5x electrophoresis buffer: 0.5 M Tris, 1.92 M glycine, 0.5% SDS pH 8.8;

5x SDS-PAGE sample buffer: 0.225 M Tris·Cl, pH 6.8, 50% glycerol, 5% SDS, 0.05% bromophenol blue;

делаю пробы так: 1 объем 5x SDS-PAGE sample buffer и 4 объема образца.

В методике написано, что после смешивания пробу можно наносить.

Вопрос: надо ли мне эти пробы кипятить? если образец: белок + (100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris·Cl, 8 M urea pH to 8.0).

мое мнение: не нужно.

Сообщение было отредактировано Cruel - 20.05.2008 12:19

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

20.05.2008 13:11

URL #156

SH- реагентов нет, значит не нужно.

Cruel
Участник
~

20.05.2008 14:12

URL #157

благодарствую Вам премного.
просто иногда как-то клинит, вроде все понятно, а получается, что надуманно.

Дюймовочка
IP-штамп: frzU85/cFFizQ
гость

28.05.2008 22:39

URL #158

Посоветуйте, плз!!! Я пищевик и пришлось столкнуться с электрофорезом и что-то не клеится!!!

Я выделяю белки изо ржи: сначала водорастворимые, затем солерастворимые - 10% NaCl, щелочерастворимые - 0,1 М NaOH и на последней стадии спирторастворимые-70% этанолом. Образцы белков храню в морозильнике перед проведением фореза. Использую разрешающий гель 10%, а концентрирующий-4%. Белки гоню при 15 V и 80А. Затем гель достаю из стекол, промываю дистил. водой и сразу провожу окрашивание готовой краской кумаси. После окрашивания геля дорожки получаются размытыми и неровными. А в другой раз и вообще на некоторых дорожках белков и не видно.

У меня крутятся в голове мысли, что может краска плохая или может быть экстрагенты как то влияют? Или еще что-то.....

Помогите, плз!

Дюймовочка
IP-штамп: frzU85/cFFizQ
гость

28.05.2008 22:46

URL #159

И еще вопросик насколько точно определяется концентрация белка биуретовым методом? И все ли белки можно им определить? Или может стоит рассмотреть определение концентрации белка другим методом???? Заранее спасибо!!!

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

29.05.2008 12:54

URL #160

Миллиметровочка! Ток 80А - это ток электросварки, при таком токе гель, не то что закипит, он прямо таки взорвется испаряясь.

НО! Даже если учесть, что Миллимитровочка описалась и это всего лишь 80mA, для 15V ток великоват. Доложите какое у вас общее сечение и длина геля.

--После окрашивания геля дорожки получаются размытыми и неровными.
Неровными это как? Извилистыми, чи шо?
Если извилистые, то вы, Миллимитровочка, плохо исходный раствор для геля перемешиваете.

-- А в другой раз и вообще на некоторых дорожках белков и не видно.
А от того и не бачите, шо нема. Я лично сильно сомневаюсь, что на 10% геле будут видны белки растворимые в 70% спирте, они скорее всего уйдут с фронтом.

-- У меня крутятся в голове мысли, что может краска плохая
Это вряд ли, но можете попробовать перед окраской вымочить гель в 40% спирте(или метаноле).
-- или может быть экстрагенты как то влияют?
Еще как, При чем все вами описанные. Соль сильно размывает зоны и дает шмеры. Щелочь по идее тоже должна размывать зоны. А спиртовые белки могут выпадать в осадок при входе в гель.
---Или еще что-то.....

Да много чего. Например, качество акриламида, бис'а, Трис'а, SDS и глицина.

А так же правильность рН в буферах для геля.

guest: Гость
IP-штамп: frzU85/cFFizQ
гость

05.06.2008 22:04

URL #161

Спасибо большое за ответ!

Доложите какое у вас общее сечение и длина геля.
Длина геля где-то 7 см, ширина - 8 см, а толщина где-то 2 мм.
Соль сильно размывает зоны и дает шмеры. Щелочь по идее тоже должна размывать зоны. А спиртовые белки могут выпадать в осадок при входе в гель
Может быть стоит попробовать выделить белки экстрагентами в более низких концентрациях??? Или не поможет?

Гость
IP-штамп: frylpe1IIoRJI
гость

20.07.2008 13:13

URL #162

подскажите, пожалуйста, какова должна быть концентрация белка для SDS-PAGE, чтобы его можно было без проблем увидеть, а то после ионообменной хроматографии делаем форез, и ничего не получаем, хотя доподлинно известно, что перед хроматографией белок был.
и вопрос второй: на каком вольтаже нужно гнать гель?

Гость
IP-штамп: fr3fNXtWnlk/U
гость

21.07.2008 14:46

URL #163

Для биохимиков, который занимаются электорофорез растворимых белков. Как можно определить концентрация белков при выделения и равномерно давать к каждому лунку.Если можно конкетно описать. Е. Заранее спасибо!!!

Knizhnik

21.08.2008 23:41

URL #164

Подскажите пожалуйста, бывало ли у кого-нибудь такое, что белковый фронт доходит до 15 кДа, а дальше не идет, хотя краска идет. С чем это может быть связано? Все гоню в 15% геле, так как нужный белок 16 кДа. Спасибо, заранее.

НЮСЛИК
IP-штамп: frRqrRwAZVaJ6
гость

02.10.2008 12:55

URL #165

подскажите пожалуйста, разгоняет ли кто-нибудь на этом свете молочные белки? просто беда какая-то с ними...... :weep:

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

02.10.2008 13:47

URL #166

подскажите пожалуйста, разгоняет ли кто-нибудь на этом свете молочные белки? просто беда какая-то с ними......

Ктон -нибудь разгоняет, но не я. А беда от того что нада казеин сначало створожить.

НЮСЛИК
IP-штамп: frRqrRwAZVaJ6
гость

03.10.2008 09:04

URL #167

что створожить-это само собой. это ясно. вот только как на фракции казеин разобрать. вот в чем вопрос. и как сыворочные белки по отношению к казеиновым себя ведут. помогите кто-нибудь

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

03.10.2008 14:01

URL #168

--вот только как на фракции казеин разобрать.
Какие фракции? Чем фракции отличаются, тем способом и разделять.
--и как сыворочные белки по отношению к казеиновым себя ведут.
Никак, плавают в молоке. В чем ваш вопрос?

нюслик
IP-штамп: frRqrRwAZVaJ6
гость

16.10.2008 08:55

URL #169

мне нужна методика выделения и идентификации белков молочного происхождения. может быть так понятнее будет. подскажите, пожалуйста, если кто-нибудь знает.

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

16.10.2008 13:51

URL #170

-может быть так понятнее будет.

Нет так еще непонятнее будет. Сколько белков столько методов как выделения, так и идентификации.

Например лактопероксидазу можно просто по активности цветной реакцией определять. Имуноглобулины А имунохимически. Ну и тд.

aed1986

19.11.2008 14:03

URL #171

Здравствуйте!
Хочу провести электрофорез гуминовых кислот, но никак не могу найти методику. Если есть такая информация, пожалуйста поделитесь!

guest: plotter
IP-штамп: frlnAsDr.5x7A
гость

27.11.2008 16:50

URL #172

Народ, два раза подряд одинаковая херь. Заливаю разрешающий, полимеризуется. Заливаю концентрирующий. После типа полимеризации вытягиваю гребенку (камера уже в буфере стоит) и весь конц. гель превращается в кашу. Ессено что туда уже ничего не внесешь и час ушел в пустую. Почему такая фигня?
Камера хеликоновская (течет кстати жутко, лучше покупайте биорад), гребенки вроде тефлоневые, прилипать не должны...

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

27.11.2008 20:01

URL #173

--Народ, два раза подряд одинаковая херь. Заливаю разрешающий, полимеризуется. Заливаю концентрирующий. После типа полимеризации вытягиваю гребенку (камера уже в буфере стоит) и весь конц. гель превращается в кашу.

Скорее всего Бис подразвалился или ПСА(ТЕМЕД) протухли.

plotter
Постоянный участник
Стыдно признаваться о том, где живу...

28.11.2008 12:25

URL #174

Бис был одолжен в соседней лабе (у них все ОК). Темед и пса новые совершенно (aps сухой в морозилке стоит) темед воняет темедом, как положенно (да и конц гель-то полимеризуется как положенно).

plotter
Постоянный участник
Стыдно признаваться о том, где живу...

28.11.2008 14:00

URL #175

кстати, а на сколько приемлемо заменять пропанол бутанолом?

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

28.11.2008 18:45

URL #176

--Бис был одолжен в соседней лабе (у них все ОК). Темед и пса новые совершенно (aps сухой в морозилке стоит) темед воняет темедом, как положенно (да и конц гель-то полимеризуется как положенно).

Ну, у меня больше нет мыслей, кроме как: концентрации не соблюдены, или набор кривой, или руки кривые.

Я бы все же начал с проверки Биса вполне возможно, что вам дали вовсе не тот что был в бутылочке, которой пользуются.

Разделяющий гель концентрированей концентрирующего и поэтому там не так заметно ухудшение механических свойств геля - это естественно.

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

28.11.2008 18:46

URL #177

--кстати, а на сколько приемлемо заменять пропанол бутанолом?

В бензобаке автомобиля - приемлимо, а вы про что спрашиваете?

plotter
Постоянный участник
Стыдно признаваться о том, где живу...

29.11.2008 17:12

URL #178

Про заливку разрешающего геля на время полимеризации буттиловым спиртом вместо пропилового. (по принципу чем богаты...)

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

01.12.2008 14:07

URL #179

--Про заливку разрешающего геля на время полимеризации буттиловым спиртом вместо пропилового.

Так там можно даже дистиллятом наслаивать. А бутанол(изобутанол) даже удобней, он с водой не смешивается.

bsm
Постоянный участник

02.12.2008 21:35

URL #180

Коллеги подскажите, меркаптоэтанол в белковом растворе должен присутствовать обязательно, или могут быть варианты... и как скажется его отсутствие на активности различных ферментов в геле.
Спсб.

Olga Vik

Бирмингем, США

02.12.2008 22:03

URL #181

(bsm @ 02.12.2008 21:35)

вроде в геле уже нет ничего активного

если не ошибаюсь, меркаптоэтанол способствует денатурации (наряду с SDS): под его воздействием происходит восстановление дисульфидных связей, что предотвращает выпетливание денатурированных полипептидов и повышение их подвижности. читала статью, в которой его специально не добавляли - такой "неденатурирующий" форез, использовали для проверки на наличие дисульфидных связей.

Сообщение было отредактировано Olga_Vik - 02.12.2008 22:07

bsm
Постоянный участник

02.12.2008 22:10

URL #182

есть информация, что меркаптоэтанол в небольших кол-вах (1-5%) добавляют в исследуемый раствор ферментов для предотвращения их от окисления и образования дисульфидных мостиков! Что как я полагаю может грозить потерей активности различных форм ферментов и как следствие их не проявлением. Поправьте если ошибаюсь.

Сообщение было отредактировано bsm - 02.12.2008 22:11

Olga Vik

Бирмингем, США

02.12.2008 23:01

URL #183

(bsm @ 02.12.2008 22:10)

вообще-то это тема по электрофорез белков, поэтому сразу уточнить стоило о чем спрашиваете =)
только вот про "активность белков В ГЕЛЕ" так и не поняла...

Сообщение было отредактировано Olga_Vik - 02.12.2008 23:03

bsm
Постоянный участник

02.12.2008 23:30

URL #184

выявление изоферментов посредством помещения геля (естественно после разгонки

) в субстрат.

Olga Vik

Бирмингем, США

02.12.2008 23:36

URL #185

(bsm @ 02.12.2008 23:30)

выявление изоферментов посредством помещения геля (естественно после разгонки

) в субстрат.

bukach
Постоянный участник
Geneva, Switzerland

02.12.2008 23:42

URL #186

отсутствие меркаптоэтанола/ДТТ может повлиять, а может и не повлиять. зависит от фермента. некоторым белкам от восстановителей наоборот кранты приходят. в основном это секретируемые белки, они часто зашиты дисульфидными связями (например инсулин, иммуноглобулины, лактальбумины).

полагаю, что в гель МЭ добавить не получится - он не должен полимеризоваться. ПСА пойдёт на окисление МЭ, а не на полимеризацию акриламида.
есть наверное заряженные восстановители, которые можно добавить в електродный буфер, если форезная система гомогенная (одинаковые буферы в геле и электродный), то и загнать прераном. вообще, преран лучше сделать, чтобы избавиться от остатков ПСА и растворы дегазировать - меньше кислороду - меньше окисления.

а проверить влияние восстановителей на ваш фермент можно?

bsm
Постоянный участник

03.12.2008 00:36

URL #187

Дело в том, что исследуется внутриклеточный гомогенат ( в котором ессесено присутствуют протеиназы и другие нехорошести разные

) вот и возник вопрос поможет ли мне меркаптоэтанол снизить влияние всяких нехороших вещей на ферменты (хотя бы на какое-то время)

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

03.12.2008 17:32

URL #188

--поможет ли мне меркаптоэтанол снизить влияние всяких нехороших вещей на ферменты (хотя бы на какое-то время)

Легче проверить, чем дать априорный адекватный ответ.

bsm
Постоянный участник

03.12.2008 20:00

URL #189

Да я понимаю. Но мало ли может кто-то сталкивался

. Бум проверять!

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

03.12.2008 20:29

URL #190

bsm!!!!! Меркаптоэтанол в колличестве 1-10 % в SDS электрофорезе добавляют не для сохранения активности ферментов. Надеятся на сохранение активности при кипячении с 2% SDS, особо нет ни каких причин, а для разрушения мостиковых S-S связей между субъединицами белков. Для сохранения активности концентрация SH-реагентов обчно 1 иногда 5-10мМ и не более 50mM.

Гость
IP-штамп: frt2DxpMm4dqI
гость

03.12.2008 21:33

URL #191

Всем привет, такой вопрос если необходимо приготовить вертикальный гель с непрерывным градиентом толщиной 6 мм, как его лучше заливать в центр или с краю...
Допустим, не буду ли я иметь сдвиг градиент вниз у центра, если заливаю из миксера в центр?

Гость
IP-штамп: frt2DxpMm4dqI
гость

03.12.2008 21:39

URL #192

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

04.12.2008 16:17

URL #193

Если вам так страшно поставте модельный эксперимент, добавив в один из градиентообразующих растворов какого-нибудь бромфенолового синего.

А так мое мнение такой 3% глицерин в оба раствора и не спешить с заливанием. А с какого краю в общем пофигу.

Гость
IP-штамп: frwgDuY2GuOp.
гость

08.12.2008 17:12

URL #194

всем привет! помогите! делаю форез сывороточных белков-все хорошо,но белки входя в разделяющий гель вдруг останавливаются,непонятно то ли они теряют заряд,то ли что....хотя при проведении фореза БФС пробежала до конца...буфер нужной концентрации,возможно концентрация геля какая-то не такая? посоветуйте что-нибудь!

plotter
Постоянный участник
Стыдно признаваться о том, где живу...

08.12.2008 18:34

URL #195

Я рэбитчью сыворотку в 7,5% геле гонял. Помоему это маловато. Лучше брать 10 или градиент.

Raido

Москва

09.12.2008 14:24

URL #196

Здравствуйте! У меня такая проблема: при разделении в 8% ПААГ-SDS фракция белков массой меньше 35 кДа "ложится" на фронт, не разделяясь, что значительно затрудняет (и даже делает невозможным) их дальнейший анализ с помощью Вестерн блоттинга. Подскажите, пожалуйста, с чем может быть связано наблюдаемое явление?

Эмин

11.12.2008 04:10

URL #197

Наверное, это связано с тем, что 8% недостаточно для разделения белков массой меньше 35 кДа.

Raido

Москва

11.12.2008 04:46

URL #198

Я тоже так думала, но самое интересное, что фирма-производитель маркера приводит изображение линейки его разделения до белка в 10 кДа для 8 - 16% геля...что, в общем-то, соответствует данным таблицы "выбора % разрешающего геля" (см. выше). Может ли рН разрешающего геля (Tris-HCl), который не 8.8, а 8.6 быть причиной наблюдаемого явления?

Guest
IP-штамп: frSyN0sznPM3.
гость

11.12.2008 12:28

URL #199

Так то для градиентного геля. Хотя все равно странно. Белок какой массы Вам нужен и почему считаете, что белки до 35 не разделяются?

Гость
IP-штамп: fr/eFUcux3Q2c
гость

12.12.2008 09:47

URL #200

Около 20 кДа. А вывод о том, что белки ниже 35 кДа не разделяются был сделан из наблюдения за "поведением" маркера: белки маркера массой менее 35 кДа идут в месте с фронтом.

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.