Все форумы > Молекулярная и клеточная биология > версия для печати
Web-адрес темы: http://molbiol.ru/forums/index.php?s=635070d6e4d1e70c790d97109e7eff7f&act=ST&f=1&t=3679

Phusion

yack 28.05.2004 15:04
Интересует мнение научной общественности о Phusion полимеразе от MJ Research. Что это за зверь? Работает с ней кто-нибудь? У меня в принципе есть первые впечатления, но пока не хочу задавать тон, может кто с ней уже давно работает. Кстати, составы HF и GC буфферов в наборе кто-нибудь знает?



Anonymous 28.05.2004 17:03
А ее по-моему недавно запустили, никто и не работал wink.gif Так что задавайте тон, интересно, че-то она больно дешевая.

[Текст переведён с транслита]



slava2001 28.05.2004 20:51
MJ на грани банкротства, если уже не..того. Взяли с поличным за машинки их - не платили понимаешь за крышу Рошу и ABI. Поэтому и полимеразка дешевая хотя может быть хорошей - хватаются за соломинку. Иногда помогает - по себе знаю. А вообще - все давно уже открыто - полимеразки всякие разные теперь являются предметом пропаганды. Внутри все те же лошадки - Так-Пфу.



Anonymous 28.05.2004 22:49
В Германии эту полимеразу продает Finnzymes через BioCat. А внутри там что-то новое кажется, проспект надо глянуть.



slava2001 29.05.2004 02:30
Да, в проспектике вам все и расскажут...
Критичнее надо быть, товаришч...



Anonymous 29.05.2004 14:27
Там оказывается в полимеразу из пирококкоса вшит ДНК-связывающий домен. Точность и процессивность обещают небывалую smile.gif
Ну так кто-нибудь работал с ней, стоит покупать?

[Текст переведён с транслита]



gostya 29.05.2004 14:34
как показывает мой опыт, бывает либо точность, либо процессивность, но может они победили природу...



Kokava 30.05.2004 23:11
Fusion? А разве его не Finzyme делает?

Пробавал я её... но что-то на человеческой геномной ДНК не удалось 4 кб получить. А весьма нужна была декларируемая точность.



E. 30.05.2004 23:26
2 UTR:
Тоже пробовал.
нормально.
Бери.



klav 19.12.2014 19:25
Продолжаем разговор smile.gif. Ест ли она праймеры с 5' конца?



-Ъ- 19.12.2014 21:34
(klav @ 19.12.2014 20:25)
Ссылка на исходное сообщение  Продолжаем разговор smile.gif. Ест ли она праймеры с 5' конца?

Самый то ... через 10 лет yes.gif
Нет, не ест, но с 3-штрих - с большим аппетитом. smile.gif



klav 19.12.2014 23:59
(-Ъ- @ 19.12.2014 22:34)
Ссылка на исходное сообщение  Самый то ... через 10 лет yes.gif
а что, как раз, ящитаю, опыт уже накопился, можно и поговорить smile.gif
Я ошибся, хотел написать 3`. Так сколько букв в секунду отъедает?



klav 20.12.2014 22:16
(yorik @ 20.12.2014 22:22)
Ссылка на исходное сообщениевечные вопросы что делать и кто виноват
да да, что делать, если не клонируется, и кто из реактивов виноват smile.gif
Если phusion реально ест буквы с 3' конца - то с какой скоростью?



-Ъ- 22.12.2014 15:56
(klav @ 20.12.2014 00:59)
Ссылка на исходное сообщение  а что, как раз, ящитаю, опыт уже накопился, можно и поговорить  smile.gif
Я ошибся, хотел написать 3`. Так сколько букв в секунду отъедает?

Надо ли Вам это, сомневаюсь confused.gif
То что она тупит концы Прдукта по ходу реакции и круто корректирует ошибки включения и при этом не спотыкается об шпильки - основное качество полимеразы.
Ну а если праймеры ваши горбатые с торчащими 3-штрих концами на шпильках и димерах - хана вашим праймерам. Объедает 3-концы и резко снижается выход продукта или вовсе блокирует реакцию. Правда, горячего старта у меня не было.
Популярно здесь:
https://www.neb.com/products/m0530-phusion-...rase#tabselect0 ( https://www.neb.com/products/m0530-phusion-high-fidelity-dna-polymerase#tabselect0 )
https://www.neb.com/products/m0530-phusion-...rase#tabselect1 ( https://www.neb.com/products/m0530-phusion-high-fidelity-dna-polymerase#tabselect1 )
https://www.neb.com/protocols/1/01/01/pcr-protocol-m0530 ( https://www.neb.com/protocols/1/01/01/pcr-protocol-m0530 )



klav 22.12.2014 16:36
(-Ъ- @ 22.12.2014 16:56)
Ссылка на исходное сообщение Ну а если праймеры ваши горбатые с торчащими 3-штрих концами на шпильках и димерах

Не, ну до такого я не докатился ещё smile.gif
(-Ъ- @ 22.12.2014 16:56)
Ссылка на исходное сообщение  Надо ли Вам это, сомневаюсь confused.gif

Ну, на самом деле, при клонировании, с любой полимеразой время от времени возникают текущие проблемы - в зависимости от ДНК-матриц, схемы клонирования, и т.д. Иногда и от особенностей полимеразы что-то зависит.
Вот я начал с phusion работать - уж хочется всё знать про неё. На всякий smile.gif
За ссылки спасибо. А Ваш личный опыт?



-Ъ- 23.12.2014 16:11
(anna2 @ 23.12.2014 15:12)
Ссылка на исходное сообщение  http://www.bioline.com/ ( http://www.bioline.com/ )

Здесь у Биолайна http://www.bioline.com/ranger-dna-polymerase.html ( http://www.bioline.com/ranger-dna-polymerase.html ) 3-пруфридин фермент с хотстартом, а тут http://www.bioline.com/accuzyme-mix.html ( http://www.bioline.com/accuzyme-mix.html ) - ФигВам smile.gif confused.gif
В первом случае, я думаю, это смесь Так с Pfu в большом избытке Так и соответствующих антител. Но большой вопрос подходят ли эти антитела к ферментам типа Pfu. confused.gif
Продукция Биолайна с "приветом из России" wink.gif .
пы сы
А почему Анна2, решил секс.ориентацию поменять? lol.gif



Gubanov Sergey 24.12.2014 01:21
Продукция Биолайна с "приветом из России" wink.gif .
пы сы
beer.gif Почему из России? скорее из Германии
пы сы
ПФУ хотстарт - как рыбе зонтик tongue.gif



klav 31.03.2015 15:01
Народ, ищу совета.
Phusion полимеразу добавляют последней, в горячую смесь, чтоб не подъедала праймеры.
Кто-нибудь пробовал не полимеразу, а праймеры добавлять последними - с этой же целью. А полимеразу - со всеми реактивами в общую смесь.
Влияет это ли на выход и специфичность ПЦР?



RNK 31.03.2015 15:22
не усложняйте себе жизнь, ни лёд, ни праймер после полимеразы добавлять не нужно.

полимераза не работает при комнатной температуре, но эксперимент надо делать быстро.

так что ставьте ПЦР с этой полимеразой, как и с любой другой полимеразой, на столе и без льда



klav 31.03.2015 15:33
Ну, лёд мне не особо усложняет жизнь smile.gif
Холодушка для ПЦР пробирок - вполне удобный штатив.
А праймер после полимеразы добавлять мне технически удобнее при градиентном ПЦР в объёме 20 мкл.
Короче, вы советуете всё (и полимеразу) мешать сразу.



X34 31.03.2015 16:04
(RNK @ 31.03.2015 16:22)
Ссылка на исходное сообщение  не усложняйте себе жизнь

именно, две-три (для спокойствия, а так и одной хватит) тиофосфорильных связей на 3' праймера. если это не сотни олигов в неделю то... shuffle.gif



RNK 31.03.2015 16:09
да, советую всё (и полимеразу) мешать сразу

вы просто ставьте эксперимент, и сами всё увидите



klav 02.04.2015 16:00
(RNK @ 31.03.2015 17:09)
Ссылка на исходное сообщение  да, советую всё (и полимеразу) мешать сразу
вы просто ставьте эксперимент, и сами всё увидите
ещё раз спасибо. Мешаю (но на льду) всё сразу, фрагменты нарабатываются нормально.



ingecate 04.04.2015 12:15
Извините, но я вас не очень-то понимаю. В России полно фирм, которые варят прекрасные полимеразы. У Диалата есть «HF-Fuzz» ничем не хуже «Phusion». Та же модифицированная Pfu’ха, а по цене и скорости поставки (по крайней мере в Беларуси) лучше из премиум ферментов не найти. Кстати, у них есть и хот-старт форма («HS-Fuzz»), хотя Pfu’ха, если все быстренько делать, и так не успевает наделать преймер димеров.
Ну и добавлю, что и простые премиксы на Taq’е как у Синтола, так и у Диалата превосходят по качеству Fermentas, NEB и т.д.



-Ъ- 06.04.2015 10:51
(ingecate @ 04.04.2015 13:15)
Ссылка на исходное сообщение  
Ну и добавлю, что и простые премиксы на Taq’е как у Синтола, так и у Диалата превосходят по качеству Fermentas, NEB и т.д.

Неужели? eek.gif Приятно удивили. smile.gif



-Ъ- 06.04.2015 10:54
(X34 @ 31.03.2015 17:04)
Ссылка на исходное сообщение  именно, две-три (для спокойствия, а так и одной хватит) тиофосфорильных связей на 3' праймера. если это не сотни олигов в неделю то... shuffle.gif

И какой смысл использования Фьюжина confused.gif Не тот случай защиты 3-штрих конца праймера.



R.J.Dio 06.04.2015 11:41
интересная дискуссия. А про точность миксов кто-нить скажет?



ingecate 08.04.2015 21:44
Приходилось сиквенировать фрагменты заклоненые как с помощью Phusion, так и с помощью HS-Fuzz – обе работают отлично, буква в букву.



ingecate 08.04.2015 22:57
(klav @ 31.03.2015 16:01)
Ссылка на исходное сообщение  Народ, ищу совета.
Phusion полимеразу добавляют последней, в горячую смесь, чтоб не подъедала праймеры.

Всегда думал, что полимеразу добавляют последней, чтобы димеры не образовывались, а про 3' подъедания праймеров никогда не задумывался. У кого-нибудь вообще такие проблемы хоть раз были?



ASDF 08.04.2015 23:07
Мне у фьюжина нравится как в инструкции написано, что при хранении фьюжина на столе в течении 6 месяцев снижения активности замечено не было. Но хранить все равно на -20.



klav 09.04.2015 00:48
ingecate, ну в инструкции прямо написано - добавлять её последней из-за 3-экзонуклеазной активности, в отсутствие буковок может подъедать праймеры.
Проблем у нас не было - но мы их и не искали smile.gif
Добавляем не просто последней, а даже в горячую смесь - для перестраховки, хотя в инструкции этого нет.



klav 09.04.2015 00:51
(ingecate @ 08.04.2015 22:44)
Ссылка на исходное сообщение  Приходилось сиквенировать фрагменты заклоненые как с помощью Phusion, так и с помощью HS-Fuzz – обе работают отлично, буква в букву.
Ну дак - если уж наПЦР-илось, почему буквам теряться? wink.gif



ingecate 09.04.2015 09:13
Да мы про точность ПЦР'а говорим, а не про потерю букв.
Если хотите про деградацию ДНК поговорить, то проверено: Phusion без дНТФ'ов грызет 3' еще как (пробовали ею затупить фрагмент после рестрикции -150 п.о. за 2 min на 72С). дНТФ дело исправляют.



ingecate 09.04.2015 09:26
(klav @ 09.04.2015 01:48)
Ссылка на исходное сообщение  ingecate, ну в инструкции прямо написано - добавлять её последней из-за 3-экзонуклеазной активности, в отсутствие буковок может подъедать праймеры.
Проблем у нас не было - но мы их и не искали  smile.gif
Добавляем не просто последней, а даже в горячую смесь - для перестраховки, хотя в инструкции этого нет.

Проблем никто не ищет, они обычно сами находятся. Единственная проблема без хот-старта (даже в руках моих студентов) - праймер димеры. Если Вам не мешают - готовте премикс хоть на комнате (все компаненты), если мешают или хотите продукта побольше/почище и т.д. - готовте на льду (все компаненты). Этого более чем достаточно.
Добавлять последней в горячую смесь (если много параллельных опытов) - большая морока, да и разброс данных будет побольше, чем при приготовлении общего премикса.



ingecate 09.04.2015 11:11
(yack @ 28.05.2004 16:04)
Ссылка на исходное сообщение  Интересует мнение научной общественности о Phusion полимеразе от MJ Research. Что это за зверь? Работает с ней кто-нибудь?

Да простят меня участники форума за 3 поста подряд, просто за Державу обидно 
«Phusion», фермент хоть и точный, но с dUTP работать отказывается (ингибируется), поэтому для больших ампликонов не годится.
«HS-Fuzz» ни капли не стесняется поднимать ампликон на 10 кб даже в руках у студентов.



-Ъ- 09.04.2015 14:53
Хорошие студенты, ну и их руководители, wink.gif у Вас в Минске!
За Державу - большое спасибо. Аналогично! beer.gif



-Ъ- 09.04.2015 14:55
(ingecate @ 09.04.2015 12:11)
Ссылка на исходное сообщение  Да простят меня участники форума за 3 поста подряд, просто за Державу обидно 
«Phusion», фермент хоть и точный, но с dUTP работать отказывается (ингибируется), поэтому для больших ампликонов не годится.
«HS-Fuzz» ни капли не стесняется поднимать ампликон на 10 кб даже в руках у студентов.

Этим постом Вы ответили на вопрос модератора 10-летней давности. yes.gif



klav 09.04.2015 15:20
ingecate, поделитесь, димеризация праймеров как-то видна по результатам ПЦР?
Ну то есть, по тому или иному виду продукта можно понять, что плохой результат именно из-за неё?
NB: мой вопрос - не наезд, не тонкая издёвка, не толстые намёки, а просто вопрос человека, знающего про ПЦР не всё. Уточняю, с учётом текущего тона общения на этом сайте mol.gif



ingecate 09.04.2015 16:55
(klav @ 09.04.2015 16:20)
Ссылка на исходное сообщение  ingecate, поделитесь, димеризация праймеров как-то видна по результатам ПЦР?
Ну то есть, по тому или иному виду продукта можно понять, что плохой результат именно из-за неё?

На форезе праймер димеры выглядят низкомолекулярным шмероа. Из-за них уменьшается количество целевого продукта, больше вероятности найти неспец., в реал-тайме смещение Ct, ну и т.д.
Если надо провести только качественный анализ +/- (в данном случае ПЦР-скрининг E. coli на вставку гена), то димеров можно и не боятся. При клонировании, количественном анализе – мешают.
Кстати, как Phusion, так и HS-Fuzz терпят целые коли, а вот на крови проверял только HS-Fuzz (до20%!). – это еще дополнительные плюсы модифицированных Pfu’х, не досягаемые простым Taq’ам и Pfu’ам. Про них же чувствительность – 5 копий на реакцию (читал статью, что меньше давать нельзя – слишком тяжелая статистика, хотя на мой взгляд и 1 копию подниму). Работают быстро (2 кб/мин) – все это по своему опыту.



Картинки:
Прикреплённое изображение



Powered by Invision Power Board (http://www.invisionboard.com)
© Invision Power Services (http://www.invisionpower.com)