Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Artin |
Возникла проблема следующего толка. В лабе полетела холодильная установка, дающая возможность хранить клетки и прочий биоматериал при -80 градусах по Цельсию. Чтобы спасти клетки (стабильные клеточные линии, используются для культивации, заморожены в DMEM-e с 10 % содержанием DMSO и 10 % FBS) пришлось перевозить их в дьюаре с жидким азотом в другую холодильную установку и оставлять уже в ней культуры на хранение при - 80 градусах Цельсия. Соответственно, теперь для культивации данных линий приходится опять использовать дьюар с азотом, везти их в свою лабу и там уже проводить разморозку вплоть до оттаивания (сразу скажу, что покультивировать клетки там где они хранятся и везти охлажденные суспензии "разогнанных клеток" я не могу). Разморозку я провожу след образом: кладу криопробирки с клетками в морозилку -20 на пол-минутки или минутку, чтобы немножко подогреть, а уже затем в водяную баню, вплоть до оттаивания; далее стандартное разбавление суспензии полной инкубационной средой, отмывка от DMSO и посев. Результат "обрадовал" уже на этом этапе: выживает процентов 10 от силы, также иногда происходит утрата типичной морфологии, в общем, пришлось изрядно проредить свою коллекцию. Видимо перепады температур с -80 до -195 и обратно клеткам явной пользы не несут. Но все бы ничего, нашлись виалки с хорошо сохранившимися образцами, разогнал я их значится, провел 5-7 пассажей, нарастил новую массу и обратно в заморозку. Как вы уже поняли, канонично подморозить суспензии до -80 и в азот не было возможности. Так что часть клеток я подморозил на -20 и в азот, а часть кинул сразу в азот после добавления DMSO. Потом отвез соответственно в другую лабу, кинул в морозилку на -80 и планировал через пару месяцев опять их покультивировать. Пару месяцев прошло, привез клетки в свою лабу (снова алгоритм описывать не буду, думаю вы уже и так поняли ), а там стабильная дохлятина выходит. Такие вот дела. Может надо как-то оптимизировать данный процесс или такая пардон "дрочка" не несет в себе никакого смысла? Какие есть идеи по данному поводу. Пы.сы: после того как бросаю виалки с криосредой (DMEM с 10 % содержанием DMSO и 10 % FBS) в жидкий азот (не важно подмороживал я ее на -20 или нет) -- по замороженной среде идут видные невооруженным глазом трещины. |
Vadim Sharov Постоянный участник Россия |
клетки необходимо замораживать медленно - понижение температуры со скоростью ~10С в минуту (варианты в зависимости от богатства: (i) программируемый холодильник; (ii) специальный контейнер (от Gibco или Stratagene); (iii) пенопластовая коробка с толщиной стенок ~1см. Контейнер или коробка помещаются в морозильник на -700С - -900С ON); на -20 замороженные клетки храняться
|
Vadim Sharov Постоянный участник Россия |
Существует мнение, что клетки лучше замораживать без антибиотиков и не в ростовой среде, а прямо в сыворотке: 85-90% сыворотка и 15-10% DMSO. Причём эти авторы рекомендуют добавлять DMSO к охлаждённой до 0оС клеточной суспензии. В некоторых лабораториях клетки замораживают не медленно, а быстро: в жидком азоте. И всё нормально. Однако в этом случае, хорошо бы подержать клетки при 4-0оС хотя бы 15', чтобы дать криоконсерванту время проникнуть в клетки. Глицерол, DMSO и медленное охлаждение предотвращают образование кристаллов льда, которые губят клетки.
|
Vadim Sharov Постоянный участник Россия |
Хранение на -20 сомнительно. В кельвинаторе должны года 2 храниться.
|
petr Постоянный участник |
У Вас проблема не на стадии разморозки. Я удивляюсь, что у Вас вообще что-то выживает. Клетки НЕ НУЖНО бросать в азот или просто кидать на -80. В следующий раз морозите следующим образом: 1. Ресуспендируете осадок в 10% DMSO в FBS 2. Кладете vial в коробочку из пенопласта или что-то термоизолирующее (мы используем кусок пенопластового рэка от пробирок на 15мл, вставленного в пенопластовую коробку с крышкой). 3. убираете коробку на -80. 4. через 2-3 дня можно перенести в азот (в принципе клетки хранятся на -80 до полугода). Разморозка - 5 мин в теплой бане, открцчиваете vial, отбираете супер, ресуспендируете осадок в среде и переносите туда, в чем растите клетки. Удачи!
|
Artin |
НО моя проблема не в том что я неправильно морожу клетки на -80. А в том что я НЕ МОГУ их правильно заморозить, т.к. сломался морозильник. Единственное что я могу себе позволить -- это подморозить их на -20 и кинуть в азот или просто кинуть азот. А также в том, что я вынужден устраивать перепады температур клеткам с -80 на -195 и обратно. Так вот есть ли вообще в этом всем смысл? Или можно просто клетки формалинчиком залить, дабы не растягивать закономерный итог -- полную гибель клеток |
vb Постоянный участник |
|
Artin |
(Vadim Sharov @ 21.09.2018 14:31) Вот с быстрой заморозкой -- это пожалуй то, что я могу сделать в нынешних реалиях. А вот фишка с держанием клеток 15 мин при -4 -- это теория или опыт? Просто у меня шансов на ошибки много не осталось, хотелось бы уточнить А то за 15 минут 10 % DMSO в теории может наделать делов, хотя минусовая температура.... А вот то что я ПОСЛЕ азота переношу их на -80 -- это нормально или не очень? Может лучше запастись азотом и хранить только там. |
Artin |
(vb @ 21.09.2018 20:04) Ну делайте ступенчатую заморозку (жидкий азот+спирт), морозьте до жидкого азота, там и храните. Чего их тягать туда-сюда? А можно подробней про ступенчатую заморозку? И что там делает спирт? Не опытен я в юзании спирта |
guest: petr IP-штамп: frESYufl5slOA гость |
|
CowDoc Постоянный участник Middle East |
Лабороторные объемы клеток не морозим, и в основном суспензионные или первичку, но обычно основной ключивой момент: - % DMSO - оптимальный для ваших клеток 5-20% (в замораживающей среде), конечный 2.5-10 в суспензии, подбираете опытным путем; - вся процедура заморозки на холоде, постоянно перемешивая, замораживающая среда ХОЛОДНАЯ; - добавлять ЗС очень медленно при постоянном перемешивании; - ну и заморозка, в лабе пенопласт.коробка или фризмене на -20, через сутки на -80, после в LN2; или в программаторе. Но это я про большие объемы заморозки, десятками литров! Ну и разумеется, через пару суток, один флакон достаем и проверяем на стерильность, % D/L, и пр Сообщение было отредактировано CowDoc - 22.09.2018 11:02 |
vb Постоянный участник |
(Artin @ 21.09.2018 17:14) Какие у вас клетки? Ступенчатая - типа к в программируемом замораживателе, только вручную, поэтому ступеньки температуры погрубее. спирт - жидкая среда теплоноситель. В пенопластовой или эва посудине. поищу методику попозже. |
CowDoc Постоянный участник Middle East |
Зачем вам заморочка со ступенчатой, или программаторами? Правильно вам советуют: - вся процедура с холодными растворами, на льду, по капельке; - в пенопластовую коробку с ячейками для крио, из морозилки!!! холодная должна быть; - от объема на 2-5 часов (нужно провалидировать) на -20, потом сразу на -70 на ночь, после в азот, и все. Хотя у вас нет азота. Да, из моего промышленного опыта заморозки объемов клеток, перенос с -70 в азот, клеткам не вредит (первичка, ВНК, VERO, MDCK). А то ведь можно дойти и до красивых игрушек ))) а-ля: Thermo Scientific™ Mr. Frosty™ Freezing Container или Recovery™ Cell Culture Freezing Medium если бюджет проекта без мозгов, а время деньги |
Vadim Sharov Постоянный участник Россия |
(Artin @ 21.09.2018 17:10) Вот с быстрой заморозкой -- это пожалуй то, что я могу сделать в нынешних реалиях. А вот фишка с держанием клеток 15 мин при -4 -- это теория или опыт? Просто у меня шансов на ошибки много не осталось, хотелось бы уточнить А то за 15 минут 10 % DMSO в теории может наделать делов, хотя минусовая температура.... А вот то что я ПОСЛЕ азота переношу их на -80 -- это нормально или не очень? Может лучше запастись азотом и хранить только там. По ссылке и у меня в цитате обычные 4, +4 Стандартная положительная температура при которой максимальная плотность воды. Я Вам представил стандартные проверенные процедуры. Раздел был создан в далекие времена, до разделения молбиола и во времена когда он был зарегистрирован как Средство массовой информации РФ. Технологически мало, что изменилось, разве что на смену парам жидкого азота пришли низкотемпературные холодильники на - 130. Замечу, что 15 минут прописано про некоторые лаборатории. В большинстве других тогда не заморачивались. Кстати, если мне память не изменяет, еще лет 25 назад использование глицирина (многоатомного спирта) в качестве криопротектора считалось архаикой. Поэтому глицирин в качестве криопротектора уже не рассматривался на заре молбиола. Хотя, в коллекции ЦИНа в СПб еще хранились "глицириновые" ампулы. Гланое медленное замораживание с криопротектором, 1 градус в минуту (важен порядок, а не точность до секунды). Это обеспечивается или коммерческим спецконтейнером или обычной, остающейся от рективов, закрывающейся пенопластовой коробочкой с толщиной стенок около 1 см. Тут тоже люфт допустим. Промежуточный этап на -20 возможен. Иногда удобен технологически. Разницы провезти через - 20 или сразу на -70 нет. Проверено. на - 70 (тут минус) хранить можно. Стабильно около 2 лет. более глубокая заморозка предпочтительней. Долгое хранение на - 20 (минус) не желательно. Кому то везет , но печальный опыт, годный только для журнала отрицательных результатов, гласит :через полгода у Вас на -20 половина дохляка будет. Еще раз правило: медленная заморозка до минус 70, быстрая разморозка. Когда Вы переносите из азота на - 70, Вы медленно размораживаете клетки. Вы можете потратить время и посмотреть, прав ли я. Но я не стал бы проверять методики молбиола. Есть работающая методика? Не меняй!!! Повторюсь на данном сайте в разделе "методы" |
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |