Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Выделение РНК из культуры клеток тризол(invitrogen)
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! AmeliRain




 прочитанное сообщение 09.05.2018 21:52     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Добрый вечер! У меня такой вопрос, нужно ли откреплять клетки из 6 луночного планшета перед добавлением тризола? Сколько нужно тризола на монослой? И нужно ли откручивать лизаты перед добавлением хлороформа? Заранее спасибо
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 09.05.2018 23:06     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

А пластик тризолом не травится? Капните на крышку чашки петри из полистирола и посмотрите.
Если не травится(не остается следов от тризола), то можно просто пипетированием тризола клетки смыть, должны слезть чулком.(но мне почему-то кажется, что травится)
Если травится, сделайте лизирующий раствор 10мМ ЭДТА и 4-5М ГТЦ или Гуанидинийхлорид(можно, но не обязательно, добавить 1/100V третьего раствора для выделения плазмид). Клетки слезут на раз. И прямо в этот буфер тризол. 3-4 части тризола на 1 ч раствора. На лунку наверное хватит 200-300мкл лизирующего раствора.

А Можете, если не лень, снять клетки трипсин/версеном и отмыть в БСА(или средой) и PBS, потом фугануть на 600-1000g и в осадок долбануть тризол. Тризола в этом случае можно меньше брать 300-400мкл на лунку.


Откручивать дебрис перед добавлением хлороформа не надо.

Сообщение было отредактировано MMM - 12.05.2018 17:01

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Ivalex
Участник оффлайн! ASDF
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.05.2018 22:59     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

1. Культуральный пластик тризолом не травиться
2. Тризолом можно заливать монослой, только среду отберите по возможности.
3. на 1 лунку 6-ти луночного планшета достаточно 0,5 мл, но какой смысл экономить? Берите 1 мл.
4. Откручивать лизаты перед хлороформом совершенно не обязательно, просто крутаните - сбросить капли с крышек.
5. Это все написано в инструкции к любому тризолу. Почитайте, вреда не будет.
Участник оффлайн! ASDF
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.05.2018 23:04     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

MMM, тризол специально придуман для того, что бы этой ерундой с лизисом клеток ГТЦ не заниматься. Зачем тогда вообще эту чачу, вами описанную, в тризол добавлять? Тогда уж посоветовали бы фенола водного к ней равный объем добавить ....

Сообщение было отредактировано ASDF - 10.05.2018 23:05
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  10.05.2018 23:57     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Note: TRI Reagent is not compatible with plastic culture plates.
https://www.sigmaaldrich.com/technical-docu...ri-reagent.html
Участник оффлайн! ASDF
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 11.05.2018 00:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Херня

Прекрасно он компатибл.
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 11.05.2018 03:45     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

Я же не против, я всего лишь предлагал проверить и если херня действовать так же как вы предложили. Проверка простая и секундная. И предложил альтенативу если все таки не херня.

Сообщение было отредактировано MMM - 11.05.2018 05:04

Всего благодарностей: 2Поблагодарили (2): Esya, berm
Участник оффлайн! ASDF
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 11.05.2018 13:00     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

Полистирол от тризола мутнеет, поэтому, например в ультрацентрифужные пробирки для лизиса вирусной бляшки я его никогда не добовляю - пробирки жалко. Поскольку культуральный пластик в любом случае идет в ведро, его можно смело заливать тризолом. На выделение РНК то, что пластик мутнеет, никак не сказывается.
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 11.05.2018 15:13     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

Ну как-то выделять ДНК с полистиролом не comme il faut. Хотя можно как угодно утверждать, что он остается в хлороформно-фенольной фракции, но как-то не порядочек, не кхасиво
smile.gif weep.gif wink.gif
Участник оффлайн! ASDF
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.05.2018 14:30     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

Есть один момент, который как то в стороне остается - что бы 100% (как тризолом) лизировать клетки ГТЦ их нужно с керамическими бусами перетрясти в гомогенизаторе. (например кайджин так и пишет об этом в инструкции мелкими буквами).

Но этим никто не заморачивается, итог - выход РНК в разы меньше, чем просто тризолом.

А по поводу пластика, вам шашечки или ехать? Никаких проблем с выделением НК из монослоя при залитии его тризолом не наблюдается в принципе.
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.05.2018 15:54     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

(ASDF @ 12.05.2018 15:30)
Ссылка на исходное сообщение  Есть один момент, который как то в стороне остается - что бы 100% (как тризолом) лизировать клетки ГТЦ их нужно с керамическими бусами перетрясти в гомогенизаторе. (например кайджин так и пишет об этом  в инструкции мелкими буквами).Но этим никто не заморачивается, итог - выход РНК в разы меньше, чем просто тризолом.


Вам видимо кто-то на мозоль наступил с ГТЦ.
Замечу, кстати, мне не нравится как Тризол лизирует материал. РНК-реагент (предыдущая версия хомченского, предназначенная только для РНК) гораздо симпатичнее в этом смысле.

И вы не внимательны. Никто не предлагал отказываться от Тризола в пользу ГТЦ. ГТЦ с ЭДТА предлагалось использовать только для снятия клеток с пластика(дабы избежать попадания пластика в материал), а затем лизис Тризолом, его никто не отменял.

(ASDF @ 12.05.2018 15:30)
А по поводу пластика, вам шашечки или ехать? Никаких проблем с выделением НК из монослоя при залитии его тризолом не наблюдается в принципе.


Вы разве не поняли, что мне и ехать, и с шашечками.
Не люблю когда в материал попадает инородная бесконтрольная полимерная чача.

Насчет того что не наблюдается в принципе. Это по-моему художественная гипербола вашей внутренней уверености в этом. У меня нет оснований подвергать сомнению вашу внутреннюю убежденность, но принципы, согласно которым примесь полистирола в тризоле не влияет на выделение РНК мне неизвестны.
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 12.05.2018 16:37     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

(MMM @ 12.05.2018 13:54)
Ссылка на исходное сообщение   ГТЦ с ЭДТА предлагалось использовать только для снятия клеток с пластика(дабы избежать попадания пластика в материал), а затем лизис Тризолом, его никто не отменял.


Это что за бред? снятие клеток ГТЦ?

Что вообще тут развели про РНК в двух тема за ахинею.
Все прекрасно выделяется и тризолом и ГТЦ, и выбор методов и подходов опрелделяется
типом образцов, его количеством, нужной фракцией РНК, и тп. Выход в ГТЦ никак не на порядок меньше чем с тризолом.
Откуда инфа про стеклянные бусы для лизиса? ГТЦ все прекрасно лизирует если и так, ну можно лизат через шприц прогнать.

На дворе 21 век, а вы тут опять про самопалные буферы и методы на коленке.
Выделять надо китами, если есть возможность.

Если дорого или очень много образцов - то пожалуйств, можно тризолом или подобным реагентами.
Евроген вон продает такой реагент, почитайте протокол как клетки лизировать. Можно прям в чашке. Если стремно - то трипсином снять и открутить. то же самое в китах qiagen, хотите Qiazol заливайте в чашку, хотите трипсинизируйте.
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.05.2018 16:59     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

(ship @ 12.05.2018 17:37)
Ссылка на исходное сообщение  Это что за бред? снятие клеток ГТЦ?

Почему бред?
Участник оффлайн! ASDF
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.05.2018 22:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

МММ, нет, мне никто не наступал на мозоль ))). Просто есть очень большой опыт по выделению РНК из клеток, тканей, жидкостей и т.д. И не просто РНК, а как правило вирусной, которая дальше на НГС, нозерн и прочее, т.е. не просто для ПЦР, а по сути препаративное, когда даже 2-4-6 кратная разница в выходе имеет значение.

Лично испытаны практически все киадженовские РНК киты, несколько Зиморесечей и т.д.
Так вот самая эффективная по чистоте и выходу схема это лизис клеток тризолом, а затем водную фазу на колонку из RNeasy или любую другую (это кстати есть у них такой кит - для жирных тканей).
Что бы убедиться в этом достаточно просто выделить РНК из двух одинаковых матрасов тризолом и просто китом и измерить РНК на Qubit.
Судя по комментариям никто из участников темы этого не делал, а я делал и поэтому пишу с такой уверенностью.


Возвращаясь к сути вопроса: ТС спросил можно ли ему заливать монослой тризолом, я ему рекомендую - не просто можно, а нужно )).
Участник оффлайн! ASDF
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.05.2018 22:53     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

(ship @ 12.05.2018 17:37)
Ссылка на исходное сообщение  Это что за бред? снятие клеток ГТЦ?

Что вообще тут развели про РНК в двух тема за ахинею.
Все прекрасно выделяется и тризолом и ГТЦ, и  выбор методов и подходов опрелделяется
типом образцов, его количеством, нужной фракцией РНК, и тп. Выход в ГТЦ никак не на порядок меньше чем с тризолом.
Откуда инфа про стеклянные бусы для лизиса? ГТЦ все прекрасно лизирует если и так, ну можно лизат через шприц прогнать.

На дворе 21 век, а вы тут опять про самопалные буферы и методы на коленке.
Выделять надо китами, если есть возможность.

Если дорого или очень много образцов - то пожалуйств, можно тризолом или подобным реагентами.
Евроген вон продает такой реагент, почитайте протокол как клетки лизировать. Можно прям в чашке. Если стремно - то трипсином снять и открутить. то же самое в китах qiagen, хотите Qiazol заливайте в чашку, хотите трипсинизируйте.


здесь речь как раз о самых фирменных китах и растворах. Про то, что для эффективного выделения РНК пробы нужно гомогенизировать, написано в инструкции RNeasy. Может быть с бусами я немного перебрал (я при любом таком случае использую TissueLyser ))), но дополнительный степ гомогенизирования в лизирующем буфере просто необходим и об этом написано в инструкции. Я только отметил, что на этот момент обычно забивают.
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 13.05.2018 07:19     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

Вот Евроген тоже рекомендует в методичах поливать свой тризол в культур-пластик. Но у них вся методичка вообще носит очень отчетливый отпечаток РНКазофобии. Клетки трипсином не снимать, PBS не промывать и тд. Как-будто их перед пересевом трипсином не снимали и как будто в культуралке РНКазы отсутствуют напрочь, а в трипсин/версене их просто ведро(особенно хорошо РНКазы видимо чувствуют себя в трипсине). Ну, а в присутствии фенола они становятся просто агрессивными.
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 13.05.2018 14:16     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

МММ, объясните, пожалуйста, каким образом в присутствии фенола денатурированные им ферменты могут становиться "просто агрессивными"?
лишние этапы промывок вредят РНК профилю, т.к. с течением времени вследствие стресса клетки, адаптируясь к стрессу (любому), бутут менять профиль РНК, что-то разрушат, что-то наситезируют заново. Время - 5-10 мин.
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 13.05.2018 15:31     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

(ksm @ 13.05.2018 15:16)
Ссылка на исходное сообщение  МММ, объясните, пожалуйста, каким образом в присутствии фенола денатурированные им ферменты могут становиться "просто агрессивными"?

Это вопрос не ко мне а к Еврогену.

(ksm @ 13.05.2018 15:16)
Ссылка на исходное сообщение лишние этапы промывок вредят РНК профилю, т.к. с течением времени вследствие стресса клетки, адаптируясь к стрессу (любому), бутут менять профиль РНК, что-то разрушат, что-то наситезируют заново. Время - 5-10 мин.

Это конечно вопрос философский. Начиная с того, а на сколько вообще культура клеток в чашке адекватна клеткам какого либо органа или организма.

Но мое мнение такое: если вы гоняетесь за эффектами, которые нивелируются 3' обработкой в трипсин/версене, то такие эффекты достойны внимания в последнюю очередь.
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 13.05.2018 17:01     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

"Это конечно вопрос философский. Начиная с того, а на сколько вообще культура клеток в чашке адекватна клеткам какого либо органа или организма."
вопрос ни разу не философский. адекватна, если с ней адекватно работать.

"Но мое мнение такое: если вы гоняетесь за эффектами, которые нивелируются 3' обработкой в трипсин/версене, то такие эффекты достойны внимания в последнюю очередь."
ну вот человек вам про вирусную РНК пишет выше.

"Это вопрос не ко мне а к Еврогену." - не нашел у Еврогена ничего об этом

Сообщение было отредактировано ksm - 13.05.2018 17:05
Участник оффлайн! Carbon Copy
Постоянный участник
So close no matter how far



 прочитанное сообщение 14.05.2018 16:52     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

(ksm @ 13.05.2018 12:16)
Ссылка на исходное сообщение  МММ, объясните, пожалуйста, каким образом в присутствии фенола денатурированные им ферменты могут становиться "просто агрессивными"?
лишние этапы промывок вредят РНК профилю, т.к. с течением времени вследствие стресса клетки, адаптируясь к стрессу (любому), бутут менять профиль РНК, что-то разрушат, что-то наситезируют заново. Время - 5-10 мин.

А Вы разве не на льду с РНКой работаете?
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 14.05.2018 17:20     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

во льду, с денатурированной.
Участник оффлайн! Carbon Copy
Постоянный участник
So close no matter how far



 прочитанное сообщение 14.05.2018 20:45     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

(ksm @ 14.05.2018 15:20)
Ссылка на исходное сообщение  во льду, с денатурированной.

Немного неверно поставил вопрос. Вы культуру не охлаждаете, чтобы остановить метаболизм РНК и замедлить деградацию РНКазами?
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 14.05.2018 21:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #23 множественное цитирование

понял! в смысле всегда фиксирую клетки: либо заморозка в жидкий азот тканей для растений, либо фиксация спирт-фенол для прокариот, либо "РНК-позже" для животного. культуры/ткани никогда не охлаждаю до фиксации, т.к. у меня стрессо- и РНКазафобии в тяжелых формах

Сообщение было отредактировано ksm - 14.05.2018 22:10
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  20.11.2021 17:55     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #24 множественное цитирование

https://www.uptrennd.com/post-detail/hints-...-watch~ODY3MDU2
https://anotepad.com/note/read/mqg8p5jm
https://www.crokes.com/replicarolexwatches/profile/
https://ko-fi.com/post/Watches-Shopping-Gui...-Watc-E1E13PZV9
https://www.merchantcircle.com/blogs/replic...x-Watch/1966540
https://www.nairaland.com/6427528/watches-s...de-finding-fake
https://www.vingle.net/posts/3587193
https://fortunetelleroracle.com/sport/replica-watches-280478
https://www.goodreads.com/story/show/132736...ake-rolex-watch
https://www.diigo.com/item/note/85twz/phwr?...2395edb2dac07ea
https://github.com/ReplicawatchesUK/Replica...ake-Rolex-Watch
https://www.reddit.com/user/Bestreplicawatc...ke_rolex_watch/
https://slashdot.org/submission/13306958/wa...ake-rolex-watch
https://www.wattpad.com/1030107359-replica-...guide-finding-a
https://www.instructables.com/member/Fakero...licPreview=true
Участник оффлайн! watchesonline89
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  26.12.2022 11:18     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #25 множественное цитирование

https://telegra.ph/Advantages-Of-Replica-Watches-08-03
https://issuu.com/home/published/_6_.docx
https://www.gta5-mods.com/paintjobs/watchesswiss
https://omegawatches89.onweb.it/
https://padlet.com/omegawatches89/je3eq9ol3xzmb9bp
https://www.pinterest.com/omegawatches89/
https://knowyourmeme.com/users/omegawatches89
https://bitcointalk.org/index.php?topic=76487.new#new
https://omegawatches89.blog.hu/
https://knowyourmeme.com/forums/general/top...f-so-why?page=1
https://penzu.com/p/c6f21f5d
https://www.reddit.com/user/omegawatches89/...are_so_popular/
https://www.vingle.net/posts/4647076
https://penzu.com/p/c68b65cc
https://diigo.com/0pige9

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 29.03.24 07:42
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft