molbiol.ru -> Выделение бактериальной ДНК из растительных тканей

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Выделение бактериальной ДНК из растительных тканей

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

Лори

Москва

28.09.2012 03:10

URL #1

Посоветуйте, каким китом или методом хорошо это сделать?

В работе будут семена, проростки, корни. Предстоит отлов интродуцентов.
Заранее благодарна!

Claudia

28.09.2012 08:59

URL #2

Колонки DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) например.

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

28.09.2012 09:52

URL #3

(Claudia @ 28.09.2012 09:59)

Колонки DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) например.

Дурной пример заразителен: из всех известных китов (колонок) это самый неподходящий, особенно по цене/качеству и, к тому же, нужна ДНК "не растительная", а бактериальная... С таким же успехом можно предлагать киты, специалированные для выделения ДНК из фекалий - там тоже много клетчатки и масса бактерий. И так далее...

Guest
IP-штамп: frxbj0K9xj17w
гость

28.09.2012 14:50

URL #4

Много читала, выводы неутешительны

Насколько я понимаю, как ни изощряйся, всё равно выделится много пластидной ДНК (хлоропласты, лейкопласты), и её будет больше, чем бактериальной... не меньше уж точно =(

Меня тут коллеги поправили, будет интересовать не только конкретный микроорганизм, но и всё сообщество(филлосфера, ризоплана). ДНК будет использоваться для ПЦР и ДГГЭ, так что излишняя "растительная" ДНК точно помешает.

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

28.09.2012 15:32

URL #5

(Guest @ 28.09.2012 14:50)

Много читала, выводы неутешительны

почему помешает ПЦР-ДГГЕ ?

птаха
Постоянный участник

29.09.2012 09:29

URL #6

как мне представляется если удастся (с помощью фильтрации или центрифугирования) получить фракцию гомогената растительной ткани обогащенную клеточными органеллами и бактериями, но не содержашую неразрушенные растительные клетки
и потом
избирательно разрушить хлоро- и прочие пласты (они будут куда менее устойчивы к осмотическому шоку, детергентам или ультразвуку) а затем опять же сделать еще один этап центрифугирования или фильтрации, то мы получим фракцию содержащую почти исключительно бактериальные клетки - и из них уже выделить НК любым доступным методом ..... PROFIT

все это мое глубокое имхо
ничем подобным мне ранее заниматься не приходилось

Andrew
Постоянный участник
Москва

01.10.2012 10:44

URL #7

Все-таки непонятно почему же пластидная или ядерная ДНК должны мешать ПЦР-ДГГЕ? Если речь об амплицикации 16S, то почему быть не взять праймеры, которые не работают с 16S из пластид (http://www.lutzonilab.net/primers/page604.shtml).

Сообщение было отредактировано Andrew - 01.10.2012 10:45

Файл/ы:

suppl.doc
размер: 31.5к
кол-во скачиваний: 607

Panaev
Постоянный участник

01.10.2012 11:04

URL #8

Как не изгаляйся, у вас всегда выделится тотал ДНК. Ну может обогащенная в 2-3-4 раза целевой фракцией. Но в ситуации, когда у вас целевая ДНК составляет доли прцента от тотал, это неважно.
Варианта два:
1. Подбирать праймеры.
2. Выделять ваши бактерии на селективных средах.

RJ Dio
Постоянный участник

01.10.2012 12:57

URL #9

RealGenomics киты попробуйте, купите по РусХембио, как там они называются

птаха
Постоянный участник

01.10.2012 19:12

URL #10

Думаю, протокол будет сильно приблизительно такой.

Берем сто грамм биомассы молотим на блендере для получения гомогената. Заливаем 500 мл изотонического раствора. Центрифугируем при 200 g 5 минут. Думаю, при этом осадятся 99 процентов неразрушенных растительных клеток (обогащение 100 X). Надосадок фильтруем через глубинный фильтр 20 мкм, при этом отфильтруются 99% из оставшихся в надосадке клеток (суммарно 10 000 кратное обогащение). В 450 мл фильтрата имеем бактерии, органеллы, фрагменты клеток, нуклеопротеидные комплексы. Доводим объем дистиллятом до 5000 мл. Все хлоропласты лопаются , НК высвобождаются в раствор. Центрифугируем для осаждения бактерий при 3 000 g 10 мин. Хроматин при таких оборотах осаждаться из раствора не будет. Осадок ресуспендируем в 10 мл ФСБ.

Получаем 10000 кратное обогащение при 10 кратном концентрировании. Ни об каком тотале речи как видите не идет.

Сообщение было отредактировано птаха - 01.10.2012 19:13

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

02.10.2012 09:44

URL #11

У Птахи страсть к масштабированию всего.

vb
Постоянный участник

02.10.2012 19:51

URL #12

(птаха @ 01.10.2012 17:12)

Получаем 10000 кратное обогащение при 10 кратном концентрировании. Ни об каком тотале речи как видите не идет.

мне тут видится одна проблема. я, конечно, в ботанике как свинья в апельсинах, но из общих соображений и наблюдений мне сдается, что бОльшая часть бактерий-симбионтов любит прикрепляться к клеткам макроорганизма. поэтому в худшем случае никакого концентрирования не произойдет (как бы вы не потеряли на фильтре основную часть бактерий), а в лучшем произойдет селективное обогащение теми, кто хуже прикрепляется к целлюлозе и прочим пенькам давленым.

птаха
Постоянный участник

03.10.2012 06:22

URL #13

согласен, для бактерий-симбионтов будет наблюдаться скорее всего именно такая картина как Вы и описали.
Но автор не словом не упомянул о симбионтах, а целиком сосредоточил наше внимание на бактериях интродуцентах. Как мне представляется, смысл этих понятий скорее можно охарактеризовать как противоположный.

птаха
Постоянный участник

03.10.2012 06:47

URL #14

а нет
во втором своем послании
автор сообщает,
что его, в том числе, интересует ризоплан. многие из тамошних бактерии действительно будут скорее всего прикрепляться к корневой системе с помощью каких-либо специальных механизмов, так что я снимаю свое предложение с повестки дня как нецелесообразное.

Сообщение было отредактировано птаха - 03.10.2012 06:53

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

03.10.2012 09:57

URL #15

Выделяем тотальную ДНК, делаем серию разведений и на реал тайм ПЦР. Но без калибровочных извращений все равно не обойтись. Определение доли ГМО в продуктах - задача похожая.

vb
Постоянный участник

03.10.2012 19:39

URL #16

(птаха @ 03.10.2012 04:22)

Как мне представляется, смысл этих понятий скорее можно охарактеризовать как противоположный.

я же говорю, как свинья

. я даже не знаю что такое интродуценты в данном контексте

птаха
Постоянный участник

04.10.2012 04:35

URL #17

вот напр.

Файл/ы:

12901221.pdf
размер: 260.17к
кол-во скачиваний: 771

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

04.10.2012 12:00

URL #18

(Andrew @ 01.10.2012 10:44)

Все-таки непонятно почему же пластидная или ядерная ДНК должны мешать ПЦР-ДГГЕ? Если речь об амплицикации 16С, то почему быть не взять праймеры, которые не работают с 16С из пластид (хттп://щщщ.лутзонилаб.нет/примерс/паге604.штмл).

Если речь об амплицикации 16S- то тогда 454 пиросиквенс или Иллумина и не связыватся с ПЦР-ДГГЕ

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

04.10.2012 12:15

URL #19

http://www.nature.com/nature/journal/v488/...ature11237.html

Лори

Москва

04.10.2012 13:56

URL #20

(птаха @ 04.10.2012 02:35)

вот напр.

Со статьей очень угадали, Антон

именно такие интродуценты, которые путешествуют из почвы/семян в растения.
А рекомендации дельные, спасибо! Если мы возьмемся за такую сложновычурную задачу, обязательно используем.

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

04.10.2012 14:29

URL #21

(Лори @ 04.10.2012 13:56)

Со статьей очень угадали, Антон

там про екскременты крупного рогатого скота (ЕКРС)

птаха
Постоянный участник

04.10.2012 16:52

URL #22

>> пиросиквенс или Иллумина

вот еще "очень сильное колдунство"

In Situ Identification of Plant-Invasive Bacteria with MALDI-TOF Mass Spectrometry
http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%...al.pone.0037189

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

04.10.2012 16:58

URL #23

(Guest @ 28.09.2012 14:50)

Много читала, выводы неутешительны

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3441234/

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

04.10.2012 17:42

URL #24

(птаха @ 04.10.2012 16:52)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18631363

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

04.10.2012 18:31

URL #25

(птаха @ 01.10.2012 19:12)

http://ebtl.yonsei.ac.kr/korean/files/high...bivore_gut..pdf

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

04.10.2012 18:35

URL #26

(Guest @ 04.10.2012 18:31)

http://ebtl.yonsei.ac.kr/korean/files/high...bivore_gut..pdf

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20838785

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

05.10.2012 08:32

URL #27

(Guest @ 28.09.2012 14:50)

Много читала, выводы неутешительны

метод "грубой силы"

http://www.colorado.edu/eeb/EEBprojects/Fi...ISMEJ_HiSeq.pdf

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

05.10.2012 10:29

URL #28

(Guest @ 28.09.2012 14:50)

Много читала, выводы неутешительны

http://www.protocol-online.org/biology-for...osts/27699.html

watchesbiz
Постоянный участник

09.12.2021 16:02

URL #29

http://www.authorstream.com/Replicawatches24/
https://about.me/Replicawatches24
https://moz.com/community/users/17050093
https://trello.com/rolexrelicawatches/activity
https://replicarolexwatches.dreamwidth.org/365.html
https://visual.ly/users/watcheshutuk/portfolio
https://www.viki.com/users/watcheshutuk_549/about
https://www.academia.edu/s/14bdb7d4fe?source=link
https://www.slideshare.net/Nowseore/guide-o...ex-watch-online
https://audiomack.com/rolexrelicawatches
https://soundcloud.com/replicarolexwatches
https://www.bagtheweb.com/u/fakerolexwatches/profile
https://www.flipsnack.com/ReplicawatchesUK/...ca-watches.html
https://www.4shared.com/office/zA4L7Rmzea/G...hase_a_Fak.html?
https://codepen.io/Rolexrelicawatches/full/abBEzaQ

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.