Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
himik Постоянный участник не родина |
Помогите, пожалуйста, разобраться с одной задачей. Дано: 3 нейрона улитки, связанные друг с другом. Надо: посчитать число дендритных шипиков у этих нейронов до и после воздействия. Предлагается иммуногистохимический метод с использованием антител к синаптофизину. Вопросы: 1) возможна ли количественная оценка? 2) насколько к 3 нейронам вообще применим данный метод? Спасибо. |
ship Постоянный участник Moscow |
Но все эти подсчеты мало стандартизированы, все зависит от целей исслеледования, наличия оборуования, опыта и тпп. Часто смотрят это в time lapse, динамику формирования. Вам это для чего нужно? Считать надо конечно не 3 клетки, а десятки. Ну и в 2-3 повторах эксперимента. Какое у вас оборудование? Во что смотреть будете? Если планируете фиксировать клетки - и смотреть во обычный флоуресцентный микроскоп - то достоверно вряд ли чтото насчитаете, если эффект не лишком выражен. В идеале надо все в 3D смотерть, тк шипики и отростки есть в разных плоскостях (апиакльные и латеральные). В целом - все эти методики зависят от лаборатории и опыта и возможностей исследователей. И зачастую тому что есть в статьях - нельзя доверять, ибо непонятно кто, что и как считал. |
himik Постоянный участник не родина |
Для того, чтобы понять, стало ли между клетками больше синапсов после воздействия. - Считать надо конечно не 3 клетки, а десятки. Ну и в 2-3 повторах эксперимента. У улитки есть 3 нейрона, ответственных за рефлекс, который будет формироваться в эксперименте. Что происходит с остальными нейронами - нам неважно. Именно их я и имел в виду. Естественно, будет набираться статистика по нескольким животным. - Какое у вас оборудование? Во что смотреть будете? У нас никакого оборудования нет, мы выступаем заказчиками. А нам предлагают иммуногистохимию для 3 нейронов, поэтому я пытаюсь разобраться, адекватный ли метод нам предлагают. Идеальный вариант для нас - электронная микроскопия с подсчётом плотности шипиков в единицах штуки на микрон длины (к примеру). Но она недоступна. Сообщение было отредактировано himik - 24.04.2017 03:23 |
ship Постоянный участник Moscow |
|
himik Постоянный участник не родина |
(ship @ 24.04.2017 16:11) А как вы эти три нейрона будете отличать от всех остальных? Иммуногистохимию на срезах обычно делают, вы же не можете сделать срез чтобы весь нейрон попал, а антитела нормально не покрасят ткани целого организма, как мне кажется, да и визуализировать и считать потом как? 1. У улиток многие нейроны легко идентифицируемы и внесены в атласы. 2. Да, не можем сделать так, чтобы нейрон попал в срез. Собственно, я поэтому и задаю вопрос специалистам, потому как гистологический метод и единичные нейроны я как-то не соотношу. 3. Ну, если будет светиться каждый шипик (а я не знаю, как оно там), то считать нормально. Но я не уверен, как оно там :-) |
ship Постоянный участник Moscow |
|
himik Постоянный участник не родина |
(ship @ 24.04.2017 20:03) вам бы в эти нейроны просто ввести флуоресцентный белок, типа RFP, чтобы метил их селективно, ну и тогда можно пытаться считать даже на живых клетках, или фиксировать. Спасибо за идею, конечно, но, полагаю, это уже иной уровень финансирования, который мы не потянем. |
ship Постоянный участник Moscow |
|
ECH Участник |
Что такое синаптофизин? Везикулярно ассоциированый белок синаптических терминалей. Является ли он маркером дендритных шипиков? Ни разу. Красили ли нейроны улитки антителами на синаптофизин? Да, навскидку из пабмеда работа 1990 года и многие другие. Интерпретировали ли это как число дендритных шипиков? Нет. Что является маркерами постсинапсов и дендритных шипиков у тех нейронов и зверей, у которых они есть? Из часто используемых psd95 и homer. Красили ли улиток на них до и после воздействия? Много раз - идем обратно в пабмед. А есть ли у нейронов улиток вообще дендритные шипики? Вопрос несколько грубый, но справедливый. Пабмед выдает только одну ссылку на русском 1992 года, некая Брежная, с одним цитированием.
|
himik Постоянный участник не родина |
(ECH @ 27.04.2017 15:25) Я с вами согласен, в принципе, но невозможно быть узким специалистом во всём. Мы положились на тех, кто занимается иммуногистохимией. (ECH @ 27.04.2017 15:25) Что такое синаптофизин? Везикулярно ассоциированый белок синаптических терминалей. Является ли он маркером дендритных шипиков? Ни разу. А можно ссылку, почему не является? (ECH @ 27.04.2017 15:25) Красили ли нейроны улитки антителами на синаптофизин? Да, навскидку из пабмеда работа 1990 года и многие другие. Спасибо. (ECH @ 27.04.2017 15:25) В принципе, это не означает, что это нельзя интерпретировать как маркер дендритных шипиков. (ECH @ 27.04.2017 15:25) Что является маркерами постсинапсов и дендритных шипиков у тех нейронов и зверей, у которых они есть? Из часто используемых psd95 и homer. Красили ли улиток на них до и после воздействия? Много раз - идем обратно в пабмед. Спасибо, глянем. (ECH @ 27.04.2017 15:25) А есть ли у нейронов улиток вообще дендритные шипики? Вопрос несколько грубый, но справедливый. Пабмед выдает только одну ссылку на русском 1992 года, некая Брежная, с одним цитированием. Спасибо, изучим. Сообщение было отредактировано himik - 28.04.2017 14:39 |
himik Постоянный участник не родина |
(ECH @ 27.04.2017 15:25) А есть ли у нейронов улиток вообще дендритные шипики? Вопрос несколько грубый, но справедливый. Пабмед выдает только одну ссылку на русском 1992 года, некая Брежная, с одним цитированием. Похоже, кина не будет и этот ваш вопрос был ключевым... Spiny neurons are rarely found in lower organisms (for example, Drosophila melanogaster and Caenorhabditis elegans ), indicating that spines evolved to accommodate the more complex functions of ‘advanced’ nervous systems, such as the mammalian brain. Сообщение было отредактировано himik - 28.04.2017 15:47
|
himik Постоянный участник не родина |
Число дендритных шипиков у высших животных коррелирует с числом синапсов. У улиток, похоже, шипики отсутствуют. Однако нашлась статья, в которой авторы связывают экспрессию синаптофизина в нейронах нужного нам организма, прудовика, с числом синапсов: Таким образом, наблюдение за экспрессией этого белка с повестки дня не снимается. Возникает второй вопрос. В статье изучали экспрессию в культуре сдвоенных нейронов, пре- и постсинептических, которые, насколько я понял, находят друг друга в культуральной жидкости. Мы хотим всё это увидеть не в культуре, а в организме. Известны нейроны, которые образуют сеть. Подскажите, пожалуйста, каким образом это следует поступить? Извлекать нейроны, искать место контакта и его окрашивать? |
ECH Участник |
|
himik Постоянный участник не родина |
(ECH @ 06.05.2017 22:17) внимательнее читайте статью на какой модели они работают. конечно находят если один нейрон физически впечатать в другой Да, я потом прочитал внимательнее и понял, что нейроны друг друга не находят :-), а их заставляют найтись. Вы думаете, что изолировать места контактов и выделить это всё из улитки, чтобы потом обработать антителами, не получится? |
ECH Участник |
|
himik Постоянный участник не родина |
|
ECH Участник |
|
MMM Постоянный участник |
|
himik Постоянный участник не родина |
(MMM @ 10.05.2017 21:12) Экспрессию белка можно посмотреть Western'ом, RT-qPCR'ом. RT-qPCR'ом проще всего если известна нуклеотидная последовательность гена. Антитела тоже можно получить это месяца 3-4 работы либо на синтетический пептид, либо на продукт клонированного гена, опять же если известна нуклеотидная последовательность гена. Более сложный вариант это трансфекция клеток репортерным вектором, где под промотором гена интереса вставлен репортерный продукт, например, флуоресцентный белок или люцифераза, для вашего случая - это самый геморрой, потому что потребуется культивирование и трансфекция клеток улитки. Спасибо, конечно, но, увы, эти методы недоступны ни по финансовым причинам, ни по материальному обеспечению. Нуклеотидная последовательность неизвестна. О получении антител и трансфекции я вообще молчу . |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |