 * |   |
|
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда |  Zbio-wikiNG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: |
|
Правила
* Механические гомогенизаторы и дурацкие вопросы по ним -- Есть дока в тефлоновых пестиках? --
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.
   |
 Neimrut |
 07.11.2018 13:45
1. В протоколе по выделению крупных органелл из нервной ткани предписано в начале размочалить мозг несколькими ударами неплотно входящего в плунжер пестика, а потом уже использовать плотный. Зачем? Какой смысл? 2. Важно ли соотношение объема буфера к объёму ткани, помещенной в плунжер? Жидкости должно быть хотя бы в несколько раз больше, но будет ли разница для выхода неразрушенных клеток, если я помещу, например, полушарие мозга мыши в 5 мл и в 10 мл буфера на шаге с гомогенизатором? 10 мл буфера на мышиное полушарие - это тоже из литературы, но как-то неэкономно, на мой взгляд. 3. Если гомогенизировать ткань в чуть гиперосмотическом буфере, то клетки должны немного сжаться и в целом стать плотнее, что (умозрительно) должно помочь повысить % выхода неразрушенных. Гипоосмотические условия, напротив, используются для облегчения разрушения. Там, где стоит задача получить суспензию неразрушенных клеток (проточная цитометрия), часто используются буферы без Ca/Mg, чтобы снизить клеточную адгезию. Осмотическая сила там чуть пониже (концентрация солей 149 мМ и 154 мМ для DPBS без и с ионами, соответственно) Не вредит ли это выходу целых клеток при использовании гомогенизатора? |
|
Kostia Участник Москва |
08.11.2018 15:52
2. Важно. Люди специально подбирают условия гомогенизации. 3. Вопрос неясен. Желаю успехов! К. |
|
Neimrut |
08.11.2018 17:03
(Kostia @ 08.11.2018 16:52)  1. Разок попробуйте - поймете - всунуть плотный пестик в неразрушенную ткань будет очень непросто...2. Важно. Люди специально подбирают условия гомогенизации. 3. Вопрос неясен. Желаю успехов! К. Спасибо за ответ, конечно, но хотелось бы более развернуто, тем более что по п. 1 согласиться не могу - прекрасно единственное полушарие что мыши, что крысы превращается в жижу плотным пестиком. Я же не весь гомогенизатор мозгами забиваю, и авторы протокола тоже об одном полушарии писали. Я подозреваю, что если ткань не размочалена, то это может создать неблагоприятные условия для клеток или крупных органелл (ядра) внутри куска, больше вероятности их разрушить. п.2 - вот здесь хотелось бы подробней. п.3. Концентрация солей ниже - среда более гипоосмотическая, верно? Это по идее облегчает разрушение клеток при гомогенизации. Но если стоит цель получить суспензию неразрушенных клеток, это минус. С другой стороны, для суспензии нужен буфер без Ca/Mg, чтобы снизить адгезию. Как поступить? Или, может, разница концентрации солей в 5 мМ между буфером с и буфером без этих ионов несущественна? Сообщение было отредактировано Neimrut - 08.11.2018 20:30 |
|
vb Постоянный участник |
08.11.2018 22:20
(Neimrut @ 08.11.2018 15:03) С другой стороны, для суспензии нужен буфер без Ca/Mg, чтобы снизить адгезию. Как поступить? Или, может, разница концентрации солей в 5 мМ между буфером с и буфером без этих ионов несущественна? я думаю, что кальций и магний в буферных растворах не вносят существенный вклад в осмолярность. с другой целью их там держат. |
|
Blaid Постоянный участник |
09.11.2018 13:14
Так поступают с целью обеспечить полную и равномерную гомогенизацию образца. А с органеллами (любыми), если пестик имеет штатный зазор (обычно - 0,2-0,3 мм) и если не усердствовать с продолжительностью гомогенизации, и так ничего не произойдёт. А вот соотношение масса образца : объём буфера имеет важное значение и если это соотношение прописано в методике (обычно указывают), то его и следует выдерживать. От этого соотношения зависит полнота выделения внутриклеточных органелл и их интактность (в общем случае - если брать меньший объём, то органелл будет выделяться меньше и они будут больше повреждаться). У вас какой-то ценный буфер? Обычно ведь используются какие-нибудь простенькие забуференные растворы сахарозы, глицерина и т.д. Насчёт п.3 - это какие-то ваши измышления (частично верные, но по-большей части нет). В общем случае буфер для гомогенизации должен быть изотоничным, а не гипо- или гипертоничным. Для этого в состав буферов вводят соли. Клетки и так разрушатся, без всяких игр с набуханием-сжатием. Наличие - отсутствие Ca/Mg важно для культуральных сред (в случае клеточных культур). Для адгезии клеток на подложку в общем. А в случае гомогенизации тканей и органов оно не играет роли. Для выделения же интактных (не разрушенных) клеток из тканей и органов используют другие подходы, а не гомогенизацию. Кроме того, в случае выделения органоидов и прочего из тканей и органов следует учитывать и ряд других моментов (например, не забывать про ингибиторы протеаз и фосфатаз).
|
|
Neimrut |
09.11.2018 15:09
(vb @ 08.11.2018 23:20) я думаю, что кальций и магний в буферных растворах не вносят существенный вклад в осмолярность. с другой целью их там держат.Посмотрел сейчас - да, лизис эритроцитов, самых осмотически-чувствительных элементов крови, начинается в 0.5% растворе NaCl, до 0.55% они держат. Изотонический раствор - 0.9%. Получается разница в 4 г соли на литр, это несравнимо больше, чем 5 мМ. Поэтому согласен, никакой драматической роли эти ионы не сыграют. |
|
Neimrut |
09.11.2018 15:40
(Blaid @ 09.11.2018 14:14) А если просто предварительно гомогенизируемую ткань (не суть - мозг или что-то другое) измельчить ножницами до состояния фарша и уже этот фарш гомогенизировать?Так поступают с целью обеспечить полную и равномерную гомогенизацию образца. ... ... У вас какой-то ценный буфер? Обычно ведь используются какие-нибудь простенькие забуференные растворы сахарозы, глицерина и т.д. Насчёт п.3 - это какие-то ваши измышления (частично верные, но по-большей части нет). В общем случае буфер для гомогенизации должен быть изотоничным, а не гипо- или гипертоничным. Для этого в состав буферов вводят соли. Клетки и так разрушатся, без всяких игр с набуханием-сжатием. Наличие - отсутствие Ca/Mg важно для культуральных сред (в случае клеточных культур). Для адгезии клеток на подложку в общем. А в случае гомогенизации тканей и органов оно не играет роли. Для выделения же интактных (не разрушенных) клеток из тканей и органов используют другие подходы, а не гомогенизацию. Кроме того, в случае выделения органоидов и прочего из тканей и органов следует учитывать и ряд других моментов (например, не забывать про ингибиторы протеаз и фосфатаз). Спасибо за обстоятельный ответ! Да, я думал, что можно просто порезать ткань ножницами. Предполагаю, что авторам замена пестика показалась просто более эргономичной процедурой. Буфер действительно ценный - коммерческий. Приготовить аналог можно, но трудоёмко, и храниться он так долго не будет. Есть два эксперимента - в одном выделение ядер, в другом получение суспензии клеток. Во втором случае под словом "гомогенизация" я имею в виду получение клеточной суспензии из ткани в гомогенизаторе. Для мозга это популярная методика (например: . И здесь наличие - отсутствие Ca/Mg важно. В протоколе с ядрами коктейль протеазных ингибиторов используем, да. А вот про фосфотазный не подумали) Что касается игр с тоничностью буфера - так было написано в руководстве, кажется, от Сигмы: если клетки механически устойчивы и плохо разрушаются, можно использовать гипотонический буфер для облегчения гомогенизации. Сообщение было отредактировано Neimrut - 09.11.2018 15:42 |
|
watchesbiz Постоянный участник |
 12.11.2021 18:47
? |
| « Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |
 |
· Викимарт - все интернет-магазины в одном месте · Доска объявлений Board.com.ua ·
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---
Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Powered by Invision Power Board(Trial) v2.0.0 © 2024 IPS, Inc.