Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
JaninMistic |
Сейчас есть только табличка с соотношениями - какой пациент на каком цикле вышел. Суть проблемы - как интерпретировать полученные данные? (где проводить базовую линию - baseline threshold). И еще в смеси есть краситель ROX как быть с ним?
|
Guest IP-штамп: frQCpGSFifrEU гость |
Начальник есть? |
RNK Постоянный участник СССР |
Если же гены анализируются отдельно, а не в смеси, и в сравнении друг с другом, тогда эти данные можно уже анализировать. Взять ген, который у всех образцов "идёт" одинаково или более менее стабильно-одинаково, тогда этот ген можно взять как стандарт по Ct. Другие гены в ваших образцам нужно сравнивать по этому гену, получить разницу Ct для каждого образца. И это значение dCt уже использовать для определение количественного анализа. Сообщение было отредактировано RNK - 19.02.2013 17:08 |
ship Постоянный участник Moscow |
|
JaninMistic |
(RNK @ 19.02.2013 22:04) Если вы делаете ПЦР однопробирочно, с тремя генами и детектируете это по SYBR+ROX, то что можно в этом случае вы хотите увидеть? Если же гены анализируются отдельно, а не в смеси, и в сравнении друг с другом, тогда эти данные можно уже анализировать. Взять ген, который у всех образцов "идёт" одинаково или более менее стабильно-одинаково, тогда этот ген можно взять как стандарт по Ct. Другие гены в ваших образцам нужно сравнивать по этому гену, получить разницу Ct для каждого образца. И это значение dCt уже использовать для определение количественного анализа. Гены анализируются отдельно - на каждого пациента три пробирки. На каком уровне базовую линию проводить? |
JaninMistic |
(Guest @ 19.02.2013 20:18) Если кратко. Gapb-3 ген домашнего хозяйства, Hif - отвечает за приспособленность клеток к условиям гипоксии, Pgp - за лекарственную чувствительность |
xenopus Постоянный участник Moscow |
Машина-то какая? В некоторых никаких линий не обязательно проводить, сами все считают.
|
comp3v Постоянный участник Москва |
(JaninMistic @ 20.02.2013 06:13) Если кратко. Gapb-3 ген домашнего хозяйства, Hif - отвечает за приспособленность клеток к условиям гипоксии, Pgp - за лекарственную чувствительность Занудства ради: насколько я знаю, у человека гена Gapb-3 никогда не было, есть GAPDH. (UPD: нашёл что есть integrin alpha 3 под таким псевдонимом - но его, вроде, геном домашнего хозяйства не назовёшь)Сообщение было отредактировано comp3v - 20.02.2013 08:22
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(JaninMistic @ 20.02.2013 06:09) Гены анализируются отдельно - на каждого пациента три пробирки. На каком уровне базовую линию проводить? Базовые линии программа автоматически определяет. На Сибре экспрессии генов изучать в наше время - отстойно. А положительные контроли у Вас есть? Раз спрашиваете про базовую линию, фоновые пробирки используете? Ген домашнего хозяйства тоже в отдельной пробирке? |
Statin Постоянный участник |
(JaninMistic @ 20.02.2013 06:09) Гены анализируются отдельно - на каждого пациента три пробирки. На каком уровне базовую линию проводить? Как в фильме "Добро пожаловать или посторонним вход воспрещен" - "Куда ставить - то ....." А почему по три пробирки на пациента, на каждый ген долно быть три пробирки на каждую точку разбавления.... PNK открыл вам страшную тайну про Ct , но по-партизански промолчал про другую страшную тайну - эффективность реакции Е ..... Занудства ради Pgp - это не ген - это продукт (в смысле белок) гена ABCB1 (в девичестве MDR1), которой опреляет множественную лекарственную устойчивость (и не он один кстати, еще 48 генов из семейства АВС-транспортеров)+ всякого рода глутатион-S-трансферазы и т.п. Так что оценивать для пациентов только экспрессию гена ABCB1 - есть профанация.
|
RNK Постоянный участник СССР |
(Statin @ 20.02.2013 16:54) PNK открыл вам страшную тайну про Ct , но по-партизански промолчал про другую страшную тайну - эффективность реакции Е ..... ну я по опыту знаю, что если еще и обращать внимание на эффективность реакции, то жизнь осложняется, особо для начинающих. А надо жить проще и легче, всё гениальное просто. Придумать и найти всякие проблемы также легко. Если пары ПЦР праймеров для каждого гена и по разному эффективны и скорость реакции может немного и отличаться, на сравнение величин Ct для каждого гена с контрольным геном это, полагаю, не играет никакой роли. Небольшие различия будут, но Ct выбирают когда реакция наиболее эффективна. Что же лучше всего контролировать, так это особенность каждого образца, любые загрязнения - полисахаридами, пигментами приводит к сильному снижению эффективность реакции, но опять же для всех генов. Поэтому, провожу multiplex ПЦР с разными флюоресцентными праймерами в одной пробирке. Некачественная ДНК будет ингибировать ПЦР для обоих пар праймеров, вероятно, одинаково. Но разница dCt между генами мы можем всё равно детектировать и она будет постоянной в конкретном образце, что нам собственно и надо при сравнении этого с другим образцом. |
abdula Постоянный участник |
(-Ъ- @ 20.02.2013 15:41) Базовые линии программа автоматически определяет. На Сибре экспрессии генов изучать в наше время - отстойно. А положительные контроли у Вас есть? Раз спрашиваете про базовую линию, фоновые пробирки используете? Ген домашнего хозяйства тоже в отдельной пробирке? ну у тебя и терминология |
abdula Постоянный участник |
(-Ъ- @ 20.02.2013 15:41) Базовые линии программа автоматически определяет. На Сибре экспрессии генов изучать в наше время - отстойно. А положительные контроли у Вас есть? Раз спрашиваете про базовую линию, фоновые пробирки используете? Ген домашнего хозяйства тоже в отдельной пробирке? базовые линии с домашним хозяйсством |
Агроном Постоянный участник |
Сейчас есть только табличка с соотношениями - какой пациент на каком цикле вышел. А как вы без трешолда узнали, на каком цикле кто вышел? Сообщение было отредактировано Агроном - 22.02.2013 08:56 |
Nett Постоянный участник |
|
Poshvina |
Выделяю РНК из бактерий, затем ставлю реакцию обратной транскрипции с мастер-миксом iScript reverse transcription (bio-rad) + контроль в котором отсутствует ревертаза . затем ставлю ПЦР с нужными прамерами и ампликон получается и в кДНК и в контроле без ревертазы. В чем может быть проблема? |
X34 Участник |
(Poshvina @ 02.09.2020 16:55) в голове, очевидно в её содержимом, вот не сдержался, извините |
kb1 Участник |
(Poshvina @ 02.09.2020 16:55) нужно провести анализ экспрессии генов бактерий Выделяю РНК из бактерий, затем ставлю реакцию обратной транскрипции с мастер-миксом iScript reverse transcription (bio-rad) + контроль в котором отсутствует ревертаза . затем ставлю ПЦР с нужными прамерами и ампликон получается и в кДНК и в контроле без ревертазы. В чем может быть проблема? Выделенная РНК содержит ДНК |
IAM1688 IP-штамп: frAWeMdOsBSXM гость |
|
kriz Постоянный участник |
|
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |