Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
shinavn |
Я пытаюсь оптимизировать ПЦР с праймерами, у которых комплементарный участок 20 бп и оверханг 60 ("адаптер"). Без адаптеров ПЦР работает прекрасно, нет неспецифики на геномке. Когда я пытаюсь повторить то же самое но с длинными праймерами ПЦР не идет совсемfrown.gif Праймеры остаются неизрасходованными (сингл-странд), ПЦР продукта они не образуют. Я попыталась снизить температуру отжига с 60 до 55, еффект тот же. И попробовала первые 4 цицла на 55 и оставшиеся на 72 (Тм праймера с адаптером 78), не помогло. Вторичные структуры для праймеров образуются при температурах ниже 55, и не закрывают часть комплементарную ДНК. но может кто-нибудь подскажет альтернативный вариант? |
MMM Постоянный участник |
Не очень понятно зачем и к чему такие "адаптеры" длинные. Альтернативы я вижу две. Первая Вы делаете несколько последовательных ПЦР с серией праймеров длиной не более 30 . Каждый раз последовательность праймеров должна смещаться все дальше по последовательности адаптера и при этом иметь в составе однонитевое продолжение последовательности. Вторая Вы делаете ПЦР с нормальными праймерами, с которыми она у вас идёт. Потом для порядку чистите полученный фрагмент электрофорезом. И далее делаете как бы один цикл с длинными адаптерами. Т. е. Денатурируете фрагмент, добавляете длинные праймеры("адаптеры") и отжигаете при низкой температуре (градусов 40 , минут 15-20) затем добавляете полимеразу и нуклеотиды и достраиваете фрагмент при 72 градусах тоже минут 5-10. Эту историю проще вообще делать не в циклере, а в простом термостате. Потом берете из этой пробирки небольшую аликвоту и с ней делаете ПЦР с короткими праймерами к концевым последовательностям "адаптеров" |
Asterix Постоянный участник |
Ну а напрямую с геномки тоже можно , ничего особо страшного в этом нет , надо просто добавить ДМСО , 5% скажем... и взять другую полимеразу, ну и хотстарт обязательно. делайте 54-72-94, и не мучайтесь с подбором температуры отжига , это самое последнее о чем надо думать. Ну и я так понимаю новые праймеры вам не хочется делать , но на будущее в такой ситуации минимум 25 нуклеотидов делайте комплиментарную матртице область. А лучше все 30. Это сгладит кучу возможных осложнений в реакции |
Carbon Copy Постоянный участник So close no matter how far |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
А далее по программе 72-95 град. делайте то же количество циклов, что было с "нормальными" праймерами. Все должно быть ОК, по своему опыту.
|
tipisev |
(-Ъ- @ 20.06.2019 20:37) Отжиг наоборот повышайте сколько еще позволяют 20 нт, но самое главное надо повысить ВРЕМЯ на отжиге в два-три раза (до минуты) на первых 4-5 циклах. А далее по программе 72-95 град. делайте то же количество циклов, что было с "нормальными" праймерами. Все должно быть ОК, по своему опыту. 60 оверханг Иллумина шоли наскока помню 60 бп оверханг это 16с микробиом на иллумине сделай короткий оверханг на основной пцр потом добав 3 цикла 60 бп ваамсчето делал лимон раз 60 нт оверханги Проблем небыло |
kenseq Участник |
(shinavn @ 20.06.2019 06:02) Вторичные структуры для праймеров образуются при температурах ниже 55, и не закрывают часть комплементарную ДНК вот тут поподробней про вторичные структуры |
kenseq Участник |
|
ship Постоянный участник Moscow |
(shinavn @ 20.06.2019 03:02) А вы можете для начала описать конечную цель того, что Вы делаете и что хотите получить?
|
kenseq Участник |
(ship @ 09.07.2019 13:49) шип я пцрил такие оверханги толко на микробиом 16S Illumina MiSeq |
Досадная Укушетка |
мммыч не пугай киндеров сэр ваамсчето в молбиоле есть правило праймеры на сцену |
elektrikvasilij Участник |
(shinavn @ 20.06.2019 06:02) Здравствуйте, Я пытаюсь оптимизировать ПЦР с праймерами, у которых комплементарный участок 20 бп и оверханг 60 ("адаптер"). Без адаптеров ПЦР работает прекрасно, нет неспецифики на геномке. Когда я пытаюсь повторить то же самое но с длинными праймерами ПЦР не идет совсемfrown.gif Праймеры остаются неизрасходованными (сингл-странд), ПЦР продукта они не образуют. Я попыталась снизить температуру отжига с 60 до 55, еффект тот же. И попробовала первые 4 цицла на 55 и оставшиеся на 72 (Тм праймера с адаптером 78), не помогло. Вторичные структуры для праймеров образуются при температурах ниже 55, и не закрывают часть комплементарную ДНК. но может кто-нибудь подскажет альтернативный вариант? |
elektrikvasilij Участник |
(shinavn @ 20.06.2019 06:02) Здравствуйте, Я пытаюсь оптимизировать ПЦР с праймерами, у которых комплементарный участок 20 бп и оверханг 60 ("адаптер"). Без адаптеров ПЦР работает прекрасно, нет неспецифики на геномке. Когда я пытаюсь повторить то же самое но с длинными праймерами ПЦР не идет совсемfrown.gif Праймеры остаются неизрасходованными (сингл-странд), ПЦР продукта они не образуют. Я попыталась снизить температуру отжига с 60 до 55, еффект тот же. И попробовала первые 4 цицла на 55 и оставшиеся на 72 (Тм праймера с адаптером 78), не помогло. Вторичные структуры для праймеров образуются при температурах ниже 55, и не закрывают часть комплементарную ДНК. но может кто-нибудь подскажет альтернативный вариант? повесте оверханг на втором раунде идиотам помогает скинь оверханг на второй раунд не форум а сборище киндеров если хвост длинный отреж потом оверханг дострой сплошные муки с киндерами |
nigoal123 IP-штамп: frAafNuYANUh2 гость |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |