molbiol.ru -> Люминесцентное определение АТФ в люциферин-люциферазной реакции.

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Люминесцентное определение АТФ в люциферин-люциферазной реакции. -- какой кит посоветуете? --

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

Guest
IP-штамп: frQG2qglqvAdc
гость

16.05.2008 08:15

URL #1

Уважаемые коллеги!
Появилась задача сравнить количество АТФ в разных клетках - вроде бы наиболее приемлемый способ это люминесцентный, в люциферин-люциферазной реакции. Помнится, давненько приходилось светлячков для сей цели ловить и "светящие детали" запасать

.
Сейчас - появилось немало китов. Из соображений удобства ( включены и cell- culture плашки для измерения люминесценции), да еще доставка "хоть завтра" заказал у Lonza (бывший Cambrex)- так они мне после двух недель ожидания объявляют, что компьютерная система у них реогранизуется, и о сроках поставки "ничего неизвестно", в том числе и то, когда известно будет

. Наверно, аннулировать заказ придется, особенно после такого ненавязчивого сервиса.

Пользуясь случаем - может, я и не оптимальный выбор сделал? Кто эти киты для определения АТФ в руках держал - какой бы посоветовали?

Guest
IP-штамп: frQG2qglqvAdc
гость

20.05.2008 23:49

URL #2

Народ, а как вообще концентрацию АТФ в клетках определяли? - ведь уже очень давно в учебниках сообщалось, что эта концентрация - в миллимолярной области, что-то около 3 мМ. Причем когда ни тебе HPLC, ни всех других современных возможностей еще не было. Кто-нибудь помнит, как это было сделано?

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

21.05.2008 09:56

URL #3

--Кто-нибудь помнит, как это было сделано?

Зачем помнит? У нас все ходы записаны. Экстрагировали кипятком

!!! , а потом ионобменная хроматография. Клеток надо было много, но в то время в основном с тканями работали.

Люцеферазная реакция, если не изменяет память 1954 год.

На биофаке МГУ есть копреативчик выпускающий лучшие люциферазные киты в мире. Поищите гуглем и обрящете.

Guest
IP-штамп: frQG2qglqvAdc
гость

22.05.2008 00:01

URL #4

(guest: ммм @ 21.05.2008 08:56)

На биофаке МГУ есть копреативчик выпускающий лучшие люциферазные киты в мире. Поищите гуглем и обрящете.

- спасибо! Главное, что прозвучал искомый личный опыт - после этого и погуглть можно. Правда, они, небось, "в дальнее зарубежье" не посылают - но дождемся оказии с биофака. А пока осчастливлен "презентом" от Перкин-Элмер - дали свой кит попробовать...

Экстрагировали кипятком !!! , а потом ионобменная хроматография. Клеток надо было много, но в то время в основном с тканями работали.

- ну то, что кипячением деградацию АТФ можно предотвратить, удивления не вызывает. Но никогда не задумывался, что, оказывается, АТФ может количественно переходить в "бульон"

- вот, наверно, почему им силы восстанавливают!

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

22.05.2008 19:39

URL #5

На будущее в Москве.
http://www.lumtek.ru/production/
http://www.lumtek.ru/contacts/

Поблагодарили (1): Atropos

Guest
IP-штамп: frQG2qglqvAdc
гость

22.05.2008 22:25

URL #6

Спасибо, ммм!

Guest
IP-штамп: frQG2qglqvAdc
гость

06.06.2008 08:49

URL #7

(guest: ммм @ 21.05.2008 08:56)

Экстрагировали кипятком

!!! , а потом ионобменная хроматография.

- вдогонку вопрос: а "кипяток" какой pH имел, нейтральный или щелочной? Дело в том, что в том самом даренном ките от Перкин-Элмер солюбилизация клеток и инактивация ферментов, разрушающих АТФ, ведется в сильно щелочном растворе (0, 1 М) не описанного по прочим компонентам состава, вероятно, ингибиторов

. А затем нейтрализуется при добавлении люциферина (т.е. точность с нейтрализацией критична для разброса). Мне, по условиям задачи, надо бы разные лизаты накапливать замороженными (лучше, наверно, чем сами клетки) - и затем пускать на определение АТФ в одном опыте: как долго может АТФ выдерживать такое "щелочное безобразие", даже если и при -20?
А другой кит, от "Биаффин", использует детергент (еле добился хоть у компании, что 10% Triton X-100) плюс некие ингибиторы - и инактивацию "АТФаз и прочих" кипячением, но в целом кит меньше нравится. Вот и в раздумьях - как лучше образцы накапливать.

Кстати, так и не нашел нигде, за счет каких компонентов в буферах китов реакция из вспышки "flash" ( что при 96-луночном формате требует инджектора

) переводится в менее интенсивную долгоживущую "glow"... - может, кто -то уже разбирался с этим? Все-таки "киты", при всех удобствах... что-то от профанации в них есть, когда не всегда знаешь, что льешь...

Guest
IP-штамп: frQG2qglqvAdc
гость

14.06.2008 22:29

URL #8

Неужто никто с подобными проблемами не сталкивался? - хотя бы как АТФ застабилизировать... Как говорил классик, "не верю"...

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

18.06.2008 19:07

URL #9

-- а "кипяток" какой pH имел, нейтральный или щелочной?

Дистиллят или деионизонка, где-то 5,6-6.2. 2-3 экстракции по 10-15' и в лед сразу.

Для тканей с особой АТФ-азной активностью: 5-8% ледяная хлорная кислота, тоже несколько экстракций во льду или вообще из замороженной крошки ткани с замороженой же кислотой до оттаивания. Потом нейтрализация щелочью или содой. Если калиевой, то перхлорат выпадает в осадок существенным образом.

--Кстати, так и не нашел нигде, за счет каких компонентов в буферах китов реакция из вспышки "flash" ( что при 96-луночном формате требует инджектора ) переводится в менее интенсивную долгоживущую "glow"...

Вот не уверен, но по моему Мg и арсенат или фосфат, осторожно Mg с этими остатками дает малорастворимые соли.

-- как долго может АТФ выдерживать такое "щелочное безобразие", даже если и при -20?

Вы правы для хранения АТФ идеально рН 7 и в кислоте, и в щелочи ей будет хуже, причем в щелочи хуже, чем в кислоте.

Guest
IP-штамп: frQG2qglqvAdc
гость

18.06.2008 21:39

URL #10

Спасибо большое, ммм, мои сомнения подтвердились - но сегодня разговаривал с деятелем из научного подразделения этой фирмы: на голубом глазу уверяют, что ничего АТФ не делается при всем при том. А есть ли какой-то стабилизатор - он, естественно, не ведает, а начальник будет "после дождичка в четверг", может, он и скажет, чего они туда, в эту щелочь, еще набросали

Да и то, может, скажет, потому что я сообщил, что нашел один их патент - где в качестве стабилизатора АТФ (но в этом ли ките?!) они используют метаванадат аммония. В этот перкин-элмеровский кит я "вцепился", потому что очень уж прилично выглядит солюбилизация - сразу "ничего живого" и даже различимого под микроскопом. Да и АТФазы, и вообще приличные ферменты, в таких условиях работать отказываются...

Поставлю все-таки проверочный опыт на степень сохранности АТФ. На худой конец, придется к каждому отдельному самплу замораживать и свой стандарт - для нормализации по кинетике развала АТФ...

Спасибо еще раз за поиски и изыскание талмуда.

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

19.06.2008 12:51

URL #11

Что-то мне подскзавает что в качестве стабилизатора хорош EDTA.
Про щелочь я, честно говоря, не понимаю, как можно ингибировать прямой гидролиз. Да, ванадаты будут ингибировать ферменты. Но как ингибировать гидроксил.

Guest
IP-штамп: frQG2qglqvAdc
гость

20.06.2008 00:22

URL #12

(guest: ммм @ 19.06.2008 11:51)

Что-то мне подскзавает что в качестве стабилизатора хорош EDTA

- стабилизатора в смысле предотвращения неферментативного гидролиза? как-то "отложилось", что в присутствии двухвалентных катионов такой гидролиз идет быстрее. А о предотвращении ферментативного - конечно, большинство АТФаз требуют двухвалентных ионов. Но EDTA вроде бы в солюбилизирующие среды обычно включен - даже если тоже "коммерческая тайна", чур ее

. Касательно ванадата - и АТФазы, и фосфатазы вроде бы куда лучше ингибирует ортованадат, а они почему-то остановились на мета...

Про щелочь я, честно говоря, не понимаю, как можно ингибировать прямой гидролиз.

- да и я который день изумляюсь: рад,что не я один...

Неферментативный гидролиз можно бы затормозить добавлением какой-нибудь подходящей органики - но уж как к этому на следующей стадии люцифераза отнесется.. Да и не хочется вносить кардинальные изменения в компоненты кита, к тому же без знания основного состава. Но хотелось бы понять логику процесса - как там давненько Клара Новикова, хоть и по другому поводу, высокоинтеллектуально излагала: "хочу знать, не просто кто с кем - но и ПОЧЕМУ?!"

DeRui

21.02.2014 23:59

URL #13

Уважаемые коллеги, подскажите, пожалуйста, где можно приобрести или как получить Флавинмононуклеотид восстановленный (FMNH2)?
Спасибо!

watchesbiz
Постоянный участник

03.12.2021 19:22

URL #14

https://app.ex.co/stories/bestreplicawatche...-regime-for-you
https://rolexrelicawatches.hpage.com/replica-watches-uk.html
https://www.cgmimm.com/articles/hints-to-he...lica-watches-uk
https://www.deviantart.com/fakerolexwatches...es-UK-871090193
https://replicawatches24.exposure.co/best-r...eplicawatches24
https://knowyourmeme.com/users/replicawatchesuk
https://www.scoop.it/topic/bestreplicawatch...ica-rolex-watch
https://uberant.com/article/1268140-hints-o...ca-rolex-watch/
https://devpost.com/watcheshutuk
https://www.ted.com/profiles/26540630/about
https://drive.google.com/file/d/1uTx90WraSJ...iew?usp=sharing
https://ibb.co/hgfZwb0
https://writer.zohopublic.com/writer/publis...10192bd4c742ceb
https://replicawatches24.mystrikingly.com/b...ica-rolex-watch
https://my.desktopnexus.com/ReplicawatchesU...a-rolex--31049/
https://sway.office.com/Tqm7mC7s0VWLhKAl

watchesbiz
Постоянный участник

03.12.2021 19:23

URL #15

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.