Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Guest IP-штамп: frQG2qglqvAdc гость |
Появилась задача сравнить количество АТФ в разных клетках - вроде бы наиболее приемлемый способ это люминесцентный, в люциферин-люциферазной реакции. Помнится, давненько приходилось светлячков для сей цели ловить и "светящие детали" запасать . Сейчас - появилось немало китов. Из соображений удобства ( включены и cell- culture плашки для измерения люминесценции), да еще доставка "хоть завтра" заказал у Lonza (бывший Cambrex)- так они мне после двух недель ожидания объявляют, что компьютерная система у них реогранизуется, и о сроках поставки "ничего неизвестно", в том числе и то, когда известно будет . Наверно, аннулировать заказ придется, особенно после такого ненавязчивого сервиса. Пользуясь случаем - может, я и не оптимальный выбор сделал? Кто эти киты для определения АТФ в руках держал - какой бы посоветовали? |
Guest IP-штамп: frQG2qglqvAdc гость |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
Зачем помнит? У нас все ходы записаны. Экстрагировали кипятком !!! , а потом ионобменная хроматография. Клеток надо было много, но в то время в основном с тканями работали. Люцеферазная реакция, если не изменяет память 1954 год. На биофаке МГУ есть копреативчик выпускающий лучшие люциферазные киты в мире. Поищите гуглем и обрящете. |
Guest IP-штамп: frQG2qglqvAdc гость |
(guest: ммм @ 21.05.2008 08:56) На биофаке МГУ есть копреативчик выпускающий лучшие люциферазные киты в мире. Поищите гуглем и обрящете. Экстрагировали кипятком !!! , а потом ионобменная хроматография. Клеток надо было много, но в то время в основном с тканями работали. - ну то, что кипячением деградацию АТФ можно предотвратить, удивления не вызывает. Но никогда не задумывался, что, оказывается, АТФ может количественно переходить в "бульон" - вот, наверно, почему им силы восстанавливают!
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
|
Guest IP-штамп: frQG2qglqvAdc гость |
|
Guest IP-штамп: frQG2qglqvAdc гость |
(guest: ммм @ 21.05.2008 08:56) - вдогонку вопрос: а "кипяток" какой pH имел, нейтральный или щелочной? Дело в том, что в том самом даренном ките от Перкин-Элмер солюбилизация клеток и инактивация ферментов, разрушающих АТФ, ведется в сильно щелочном растворе (0, 1 М) не описанного по прочим компонентам состава, вероятно, ингибиторов . А затем нейтрализуется при добавлении люциферина (т.е. точность с нейтрализацией критична для разброса). Мне, по условиям задачи, надо бы разные лизаты накапливать замороженными (лучше, наверно, чем сами клетки) - и затем пускать на определение АТФ в одном опыте: как долго может АТФ выдерживать такое "щелочное безобразие", даже если и при -20?А другой кит, от "Биаффин", использует детергент (еле добился хоть у компании, что 10% Triton X-100) плюс некие ингибиторы - и инактивацию "АТФаз и прочих" кипячением, но в целом кит меньше нравится. Вот и в раздумьях - как лучше образцы накапливать. Кстати, так и не нашел нигде, за счет каких компонентов в буферах китов реакция из вспышки "flash" ( что при 96-луночном формате требует инджектора ) переводится в менее интенсивную долгоживущую "glow"... - может, кто -то уже разбирался с этим? Все-таки "киты", при всех удобствах... что-то от профанации в них есть, когда не всегда знаешь, что льешь... . |
Guest IP-штамп: frQG2qglqvAdc гость |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
Дистиллят или деионизонка, где-то 5,6-6.2. 2-3 экстракции по 10-15' и в лед сразу. Для тканей с особой АТФ-азной активностью: 5-8% ледяная хлорная кислота, тоже несколько экстракций во льду или вообще из замороженной крошки ткани с замороженой же кислотой до оттаивания. Потом нейтрализация щелочью или содой. Если калиевой, то перхлорат выпадает в осадок существенным образом. --Кстати, так и не нашел нигде, за счет каких компонентов в буферах китов реакция из вспышки "flash" ( что при 96-луночном формате требует инджектора ) переводится в менее интенсивную долгоживущую "glow"... Вот не уверен, но по моему Мg и арсенат или фосфат, осторожно Mg с этими остатками дает малорастворимые соли. -- как долго может АТФ выдерживать такое "щелочное безобразие", даже если и при -20? Вы правы для хранения АТФ идеально рН 7 и в кислоте, и в щелочи ей будет хуже, причем в щелочи хуже, чем в кислоте. |
Guest IP-штамп: frQG2qglqvAdc гость |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
Про щелочь я, честно говоря, не понимаю, как можно ингибировать прямой гидролиз. Да, ванадаты будут ингибировать ферменты. Но как ингибировать гидроксил. |
Guest IP-штамп: frQG2qglqvAdc гость |
(guest: ммм @ 19.06.2008 11:51) - стабилизатора в смысле предотвращения неферментативного гидролиза? как-то "отложилось", что в присутствии двухвалентных катионов такой гидролиз идет быстрее. А о предотвращении ферментативного - конечно, большинство АТФаз требуют двухвалентных ионов. Но EDTA вроде бы в солюбилизирующие среды обычно включен - даже если тоже "коммерческая тайна", чур ее . Касательно ванадата - и АТФазы, и фосфатазы вроде бы куда лучше ингибирует ортованадат, а они почему-то остановились на мета...Про щелочь я, честно говоря, не понимаю, как можно ингибировать прямой гидролиз. - да и я который день изумляюсь: рад,что не я один... Неферментативный гидролиз можно бы затормозить добавлением какой-нибудь подходящей органики - но уж как к этому на следующей стадии люцифераза отнесется.. Да и не хочется вносить кардинальные изменения в компоненты кита, к тому же без знания основного состава. Но хотелось бы понять логику процесса - как там давненько Клара Новикова, хоть и по другому поводу, высокоинтеллектуально излагала: "хочу знать, не просто кто с кем - но и ПОЧЕМУ?!"
|
DeRui |
Спасибо! |
watchesbiz Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |