Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
AnnaF |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
|
RJ Dio Постоянный участник |
|
Noom Постоянный участник |
Если денег нет то в лоб лизируйте с протеиназой К и детергентами (Np40 + Tritonx100 в TE) в соотношении по объему проба-лиз.буфер не более чем 1:10. |
AnnaF |
|
Demyanov Постоянный участник Санкт-Петербург |
Лично я делаю так: К осадку клеток добавляем 50мкл 5% Chelex 100 (BioRad) Вортекс 10 сек Инкубируем 20мин - 95градусов. Периодически делаем вортекс. Крутим 3000g 5 мин Отбираем супер в новую пробирку. Из 2мкл супера ПЦР идет ОК. Минимальное количество клеток, которое я брал на ПЦР - 1000 штук. Если еще поколдовать, то можно довести и до 100 клеток, но вам это скорее всего не нужно т.к. в лунке обычно можно нарастить до 0,2 - 0,5млн клеток.
|
Noom Постоянный участник |
Сообщение было отредактировано Noom - 17.03.2010 12:40 |
AnnaF |
|
AnnaF |
можете подробнее написать? |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Noom @ 17.03.2010 13:34) Деньги на наборы есть? Если есть инвитрогеном выделяйте - у них есть весьма забавные схемы выделения днк для пцр. Первая с магнитными частицами, вторая с сорбционным слоем в пцр стрипах. Там даже ничего крутить не надо - закапал в стрип пробу порушил, промыл носиком, и капаешь туда мастермикс. Если денег нет то в лоб лизируйте с протеиназой К и детергентами (Np40 + Tritonx100 в TE) в соотношении по объему проба-лиз.буфер не более чем 1:10. Действительно, забавные киты, особенно с сорбционным слоем. Я бы не купил, денег жалко... |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
|
Demyanov Постоянный участник Санкт-Петербург |
|
AnnaF |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Demyanov @ 17.03.2010 13:57) Кстати, вот многие рекомендуют ПЦРить прямо с клеток. С эукариотами такой вариант у меня ни разу не получился. Чуствительные к ингибированию ПЦР смеси - БСА введите. |
Demyanov Постоянный участник Санкт-Петербург |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(AnnaF @ 17.03.2010 13:58) Пишите мне в личку. |
Demyanov Постоянный участник Санкт-Петербург |
(-Ъ- @ 17.03.2010 10:59) Дело в том, что даже намека на фрагмент нет. Мне кажется, что БСА врядли сможет так уж сильно улучшить ситуацию. Еще недавно пробовал кипятить в калийном ПЦР буфере вместо Хелекса. Тоже не получилось. Вобщем хелекс для меня - метод выбора. |
RJ Dio Постоянный участник |
(Demyanov @ 17.03.2010 13:57) Кстати, вот многие рекомендуют ПЦРить прямо с клеток. С эукариотами такой вариант у меня ни разу не получился. если взять микс для ПЦР с крови, то должно получиться- ингибиторы одни и те же |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Demyanov @ 17.03.2010 14:03) Дело в том, что даже намека на фрагмент нет. Мне кажется, что БСА врядли сможет так уж сильно улучшить ситуацию. Еще недавно пробовал кипятить в калийном ПЦР буфере вместо Хелекса. Тоже не получилось. Вобщем хелекс для меня - метод выбора. БСА нужно много, очень много, до 5 мг/ мл. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(RJ Dio @ 17.03.2010 14:16) |
AnnaF |
|
Noom Постоянный участник |
На 200 мл Tris буфер 1М pH 8,3 - 4 мл ЭДТА 0,5М - 0,8 мл Triton 100 - 1 мл NP40 (NONIDET P40) - 1 мл Протеиназа К (100x=10 мг/мл в 50% глицерине) добавляете перед лизисом из расчета 1:100. Полтора часа при 55 раз в 20-30 минут перемешивайте на вортексе, потом 15 минут при 95. Потом на 12000 rpm открутите (это для микроцентрифуги примерно 10000+g) и супернатант в ПЦР (1 к 6 нормально должно работать). Метод кондовый - недостаток в приличном разведении образца (примерно 1 к 10 чтобы ваш буфер в котором вы культивировали не помешал ПЦР и лизису). После обработки образец достаточно уверенно стоит при +4 около недели (поскольку в буфере ЭДТА он зарастать у вас не должен). Если будете на хранение убирать лучше отобрать супер и далее либо морозить на -20 супер либо переосадить ДНК спиртом, промыть и хранить очищенную днк. |
Demyanov Постоянный участник Санкт-Петербург |
http://www.evrogen.ru/products/PCR-kits/InBlood.shtml Если пришлете пробник, то обязуюсь попробовать его на кале (очень много ингибиторов). Сообщение было отредактировано Demyanov - 17.03.2010 13:37 |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Demyanov @ 17.03.2010 14:36) будет классное испытание, но вопрос к RJ Dio. Я не знаю, в состоянии ли Евроген. выдать пробник. |
RJ Dio Постоянный участник |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
|
RJ Dio Постоянный участник |
|
Demyanov Постоянный участник Санкт-Петербург |
(-Ъ- @ 17.03.2010 11:55) А я думал вы тоже оттуда. Сорри. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Demyanov @ 17.03.2010 15:13) Я не оттуда, но уважаю... Просто заметил что, RJ Dio боится сослаться на Евроген решил помочь человеку. Я считаю это нормально и никакая не реклама. |
nigoal123 IP-штамп: fr/1ZkUsuBQOE гость |
It influences some readers. |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |