Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* primer design progs
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 20.07.2004 19:33     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #51 множественное цитирование

To: Carbon Copy

"Вместо Taq нужно использовать любую другую полимеразу, у которой нет terminal transferase activity, например - Pfu, дающую blunt ends. "

Вы будете смеяться, но приходится учитывать, что Pfu намного дороже Taq. Кроме того, доступной она стала совсем недавно - несколько лет назад, а Taq - он всегда под рукой. Ещё одна заморочка - Pfu довольно быстро "сгрызает" праймеры и нужно подбирать условия, при которых это не критично, или заказывать тио-модификацию 3'-концевой фосфодиэфирной связи, а это тоже лишняя головная боль.
Участник оффлайн! DmitriM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 21.07.2004 02:36     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #52 множественное цитирование

Так у Вас же там с этим Taq куча ошибок понавылезает! Да при переамплификациях-то!
Участник оффлайн! Павел
Постоянный участник
Новосибирск



 прочитанное сообщение 21.07.2004 09:55     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #53 множественное цитирование

Ненаповылазает! Поверено, мин нет... Пороверено практически. И при мультипраймерном PCR-синтезе (не путать с мультиплексной PCR) особых проблем с "довешенными" на 3' A тоже не существует.
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 21.07.2004 10:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #54 множественное цитирование

Недавно "сороконожка" основательно потоптал меня ногами за рекомендацию избегать УФ-освещения при ЭФ-очистке ампликонов из-за возможных повреждений ДНК. Taq в этом отношении менее опасен. Переамплификации опасность не усугубляют, так как количество циклов приходится сводить к минимуму. Избыточные циклы, при которых синтез уже не идёт, увеличивают не количество ошибок, а шмер.

Что касается довеска А, то он, скорее всего, сильно не мешает, тем не менее праймеры желательно начинать с буквы, следующей за T. Тогда довесок А с гарантией не сможет чему-либо помешать, так как будет соответствовать требуемой последовательности. Во всяком случае, при таком подборе праймеров у меня проблем не было.
Участник оффлайн! alex2345
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 21.07.2004 12:33     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #55 множественное цитирование

To Veshka:

> на тубике

А это что такое? Это из серии "а что ты сделал для hip-hopa"? wink.gif
Закодировался так, что старшие товарищи перестали тебя понимать smile.gif
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 21.07.2004 14:15     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #56 множественное цитирование

Про "тубик" я у него уже спрашивал. Оказывается, это туберкулёз. Его геном отличается повышенным содержанием GC. ДНК из-за этого содержит очень много шпилек. Подбирать праймеры довольно трудно, но геном отсеквенирован целиком и, если постараться, то можно найти вполне удобоваримые участки.

Кстати, полностью отсеквенировано уже 2 штамма. При попарном сопоставлении последовательностей их генов выявляются гипервариабельные участки, указывающие на уязвимые для иммунной системы эпитопы. Жалко, что ни ПЦР-диагностика, ни разработка туберкулёзных вакцин нового поколения никого не интересуют. Даже пострадавшего от туберкулёза Вешку weep.gif .
Участник оффлайн! gostya
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 21.07.2004 16:40     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #57 множественное цитирование

туберкулез по всей видимости
Участник оффлайн!




 прочитанное сообщение 21.07.2004 19:11     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #58 множественное цитирование

Уважаемый Генсек, объясните, пожалуйста, юным комсомольцам, каким образом можно начать праймер " с буквы, следующей за Т " ( по алфавиту - это "У", что за нуклеотид такой, навороченный?
Не пойму никак, чему может помешать довешенный А, кроме тупого лигирования, и как лишняя некомплементарная буква в праймере (Т, по-видимому) избавит Вас от довешивания еще онного А ?
Участник оффлайн! Esya
Постоянный участник
PA, USA



 прочитанное сообщение 21.07.2004 19:19     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #59 множественное цитирование

а я не понимаю, чем людям GC не нравятся, nightmare из бацилл PCRить, а из GC все идет со свистом - ДМСО добавляйте и все будет хорошо, и пофигу, что GC больше, чем нужно.
Участник оффлайн! Veshka
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 21.07.2004 22:41     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #60 множественное цитирование

Автор - genseq:
To: Veshka

\"Во гимор...на таке ген собирать...\"
Если я правильно понял, то \"гимор\" - это, по-видимому, геморрой, а \"так\" - это Taq-полимераза. Собирать на \"таке\" гены - это \"гимор\" только для начинающих генных инженеров, а я этим делом балуюсь с 75 года прошлого века.

\"Чтобы не шмерило, нужно просто днтп, праймеры и полимеразку вниз загнуть.\"
KlenTag стоит использовать для устранения шмера только в том случае, если снижение количества Taq не помогает. \"Загибать\" ещё и дНТФ с праймерами нет ни какого смысла.

\"А мегапраймерные методы - вообще полный люэс.\"
С этим заболеванием пока не сталкивался.

\"Если уж мегапраймерами баловАться, надо не ассимметричный делать, а биотин 5'-концевой.\"
Кажется, что-то умное, но не пойму, что именно. Нельзя ли поподробнее?

\"И кто мешал продукт отжига с коротких праймеров в Н.У. амплифицировать?\"
Знать бы ещё, что такое \"Н.У.\".

\"И как это Вы учитывали внематочные А, когда они не в рамке получатся - вообще убей Бог не пойму... \"
Первые несколько лет было тяжело, а потом привык. Если помучаетесь столько же, то поймёте.
Генсек, нельзя всё-таки быть таким дремучим. Кстати для справки, мой стаж работы не сильно меньше Вашего. Может лет на десять если с 75 года считать. smile.gif

Отвечаю тут последний раз ибо препираться с Вами бессмысленно - а народ, которому работать надо сам поймёт что к чему.

1. ИЗ ЧЕГО это Вы в 75 году гены собирали? Я ведь могу не полениться и сходить к Чурикову и Матвиенко за точными датами, но боюсь, диагноз ЯСЕН И ТАК.

2. Как человек использующий Pfu и Pfu-подобные полимеразы лет десять или больше могу сказать, что Ваши экзерсисы насчёт сжирания праймеров - ерунда. Пять гамм с инверсника 6-8 килобаз геркулазой, например, получается довольно легко. Кроме того, посчитайте КАКОЙ ПРОЦЕНТ у Вас включается праймера lol.gif lol.gif

3. Насчёт бессмысленности загбания вниз праймеров и дНТП могу Вам весело сообщить, что в некоторых случаях победа над димерами достигается амплификацией с 5 пикомоль праймеров и <sub>50 микромоль</sub> дНТП. По-видимому Вам сие неизвестно. Вообще на те же любимые инверсники я редко беру больше 10 пикомоль праймеров. На воспетой Вами Pfu, BTW lol.gif

4. И плохо, что не сравнивали мегапраймеры с теми же инверсниками, например, по эффективности. Или есть ещё одна глупая приблуда - SOE называется. Из той же серии по эффективности. Все эти вещи пройдены на внесении рэндомизированных кусков в ДНК двадцать раз. Опять же без Вашего участия, очевидно wink.gif

5. Про биотин и ssDNA из PCR-продуктов ведро статей. Кроме того, для ssDNA из PCR есть ещё более эффективная веСЧь - любимая и ненаглядная T7 gene 6 экзо, о которой, и о том, как ей делать ssDNA из PCR-продуктов Вам тоже видимо неизвестно. А ЗРЯ smile.gif .

6. Натрансфераженная на 3'-конец буква без еЯ удаления вообще-то в собранном гене как-то портит рамку. Нет разве wink.gif ????

Всё. От сего бессмысленного препирательства я устал. Вы, Генсек, с сего момента находитесь в глубоком игноре.


PS. Вот Орм сбежал отсюда, потому как задрали такие вот. Я не сбегу, наверное, но участвовать в подобных "дискуссиях" зарекаюсь нафих...
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 22.07.2004 16:20     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #61 множественное цитирование

Очень жать, что Вешка воспринимает мнения, отличные от его собственных, как личное оскорбление. Не хочется терять такого знающего оппонента. Но вернёмся к делу. Начнём с конца (предыдущего сообщения), т.е. для начала проясним ситуацию с выступающей А.

Допустим, вам нужно подобрать праймеры для сборки ампликонов, и праймер должен ложиться на последовательность типа agtctgcatgctcgagctgacgatgc. Если выбрать так:
agtCTGCATGCTCGAGCTGACGATGC (праймерной последовательности соответствуют прописные буквы), то проблем с выступающей А не будет. Дело в том, что ампликон будет иметь на конце

5' _CTGCATGCTCGAGCTGACGATGC-----------
3' AGACGTACGAGCTCGACTGCTACG-----------

Приглядитесь к исходной последовательности и увидите, что у неё 3'-концевому А соответствует комплементарное основание T.

Если кого-нибудь интересуют методические подробности, пишите на E-mail или откройте новый топик.
Участник оффлайн! morigor

Кирьят-Арба-Хеврон, Израиль



 прочитанное сообщение 22.07.2004 17:35     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #62 множественное цитирование

Сколько, Сергей?

[Текст переведён с транслита]
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 22.07.2004 18:24     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #63 множественное цитирование

Автор - <гость>:
Уважаемый Генсек, объясните, пожалуйста, юным комсомольцам, каким образом можно начать праймер \" с буквы, следующей за Т \" ( по алфавиту - это \"У\", что за нуклеотид такой, навороченный?
Не пойму никак, чему может помешать довешенный А, кроме тупого лигирования, и как лишняя некомплементарная буква в праймере (Т, по-видимому) избавит Вас от довешивания еще онного А ?
Дорогой юный комсомолец,
дело не в тупом лигировании, а в том, что однонитевая ДНК с А на 3'-конце должна инициировать полимеразную реакцию, и если этот А не ложится на матрицу, то возможны проблемы. Для того, чтобы этого избежать, Т должна быть не в праймере, а на матрице, примыкающей к 5'-концу праймера (см. выше).

За фамильярное обзывание оснований буквами прошу прощения.
Участник оффлайн! the stranger
Участник



 прочитанное сообщение 26.07.2004 18:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #64 множественное цитирование

Автор - genseq:
 
Автор - <гость>:
[b] Уважаемый Генсек, объясните, пожалуйста, юным комсомольцам, каким образом можно начать праймер \" с буквы, следующей за Т \" ( по алфавиту - это \"У\", что за нуклеотид такой, навороченный?
Не пойму никак, чему может помешать довешенный А, кроме тупого лигирования, и как лишняя некомплементарная буква в праймере (Т, по-видимому) избавит Вас от довешивания еще онного А ?
Дорогой юный комсомолец,
дело не в тупом лигировании, а в том, что однонитевая ДНК с А на 3'-конце должна инициировать полимеразную реакцию, и если этот А не ложится на матрицу, то возможны проблемы. Для того, чтобы этого избежать, Т должна быть не в праймере, а на матрице, примыкающей к 5'-концу праймера (см. выше).

За фамильярное обзывание оснований буквами прошу прощения. [/b]
Ну все равно не понимаю я расклада confused.gif . На какую матрицу однонитевая ДНК с А, которая должна инициировать полимеразную реакцию, ложиться? По-моему, эта ДНК и есть матрица, на которой отжигаются праймеры, а им глубоко безразлично должны быть все эти А на 3'-конце. Если я не прав, поправьте, сделайте одолжение.
Участник оффлайн! the stranger
Участник



 прочитанное сообщение 26.07.2004 18:38     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #65 множественное цитирование

И еще один вопрос и опять по программам. Имею два праймера GTCGGATCCTTGAAAGACTCCATTGTA и TTCTTTGACTTACGGTTGGT. Vector NTI показывает Tm=59,7 и dG=-43,6 для первого и 46,5 и -31,1, соответствеено, для второго. А Oligo6 для тех же праймеров дает следующие значения: 73,6/-48,5 для первого и 59,6/-35,7 для второго. Как написано хелпах, обе программы считают Tm методом nearest neighbors. Такие же различия и для других праймеров. Объясните мне, кто может.
Участник оффлайн! Veshka
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 26.07.2004 19:09     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #66 множественное цитирование

Так кто же Вам объяснит, как они на самом деле считают - только разработчики и то вряд ли. Соль могла быть разная зашита, например smile.gif А пример очень показательный. Второй праймер будет плавиться сильно некооперативно и считать его вообще дело дурацкое. А для смеха можно поставить PCR со вторым праймером при 46 и при 59 градусах и посмотреть что будет. lol.gif Основная проблема как раз в том, что программы считают Tm, а нужна температура отжига для амплификации, которая Tm в общем случае не соответствует. Нормальная температура отжига для амплификации второго праймера где-то градуса 52-54.
Участник оффлайн! the stranger
Участник



 прочитанное сообщение 26.07.2004 19:15     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #67 множественное цитирование

Автор - Veshka:
  Второй праймер будет плавиться сильно некооперативно и считать его вообще дело дурацкое. Основная проблема как раз в том, что программы считают Tm, а нужна температура отжига для амплификации, которая Tm в общем случае не соответствует. Нормальная температура отжига для амплификации второго праймера где-то градуса 52-54.
А почему некооперативно? И как посчитали, что температура где-то 52-54?
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 26.07.2004 19:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #68 множественное цитирование

To the stranger:
"На какую матрицу однонитевая ДНК с А, которая должна инициировать полимеразную реакцию, ложиться? По-моему, эта ДНК и есть матрица, на которой отжигаются праймеры, а им глубоко безразлично должны быть все эти А на 3'-конце."

Отнюдь. Проблема концевого А обсуждалась в контексте сборки генов из нескольких ампликонов. Обычно при этом ампликоны стыкуются "внахлёст" и концевой А должен точно ложиться на общую последовательность, т.е. соответствовать Т, лежащей вне ампликона. Возможно, это казуистический случай, не представляющий особого интереса для решаемых Вами проблем.

Что касается OLIGO 6, то по этому поводу имею сообщить следующее:
в OLIGO 4 Tm обоих праймеров точно сответствуют тому, что даёт Vector NTI. Возможно, использованный Вами "кряк" прокрякал OLIGO6 не слишком аккуратно.
Участник оффлайн! Павел
Постоянный участник
Новосибирск



 прочитанное сообщение 27.07.2004 05:50     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #69 множественное цитирование

по поводу Tm и их отличий в разных программках. Програмки читают одинаково, проверено, просто по умолчанию в VectorNTI и Oligo заложены разные концентрации матрицы. Ее (концентрацию) можно изменить (сделать одинаковую). Оказывается (!) это влияет на температуру отжига, впрочем это явление помогает избавиться иногда от "левых" бэндов(неспецифики)...
Участник оффлайн!




 прочитанное сообщение 28.07.2004 14:51     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #70 множественное цитирование

I like online Primer3 ,works 100%
Участник оффлайн! pApA2017




 прочитанное сообщение 05.12.2017 03:51     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #71 множественное цитирование

Какой алгоритм рассчета Tm град. и ΔG kkal/mol , если считать вручную. Какие формулы используются?
Участник оффлайн! dk
Постоянный участник
Россия



 прочитанное сообщение 07.12.2017 11:29     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #72 множественное цитирование

Удивительные вопросы. Ну да алгоритм обычно все используют "простой" - типа АТ *2 + GC *4
А вообще что за удовольствие "ручками" считать Tm? Для праймеров важнее шпильки и димеры. Лично мне нравится OligoAnalyzer от idtDNA. А свободное время лучше потратить на чтение полезных книжек.
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  20.11.2021 18:20     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #73 множественное цитирование

https://wanelo.co/replicarolexwatches
https://musescore.com/fakerolexwatches
https://www.racked.com/users/Replicarolexwatches
https://sketchfab.com/Rolexrelicawatches
http://www.video-bookmark.com/bookmark/433...eplica-watches/
https://www.slideserve.com/ReplicawatchesUK...pt-presentation
https://www.theverge.com/users/Replicarolexwatches
https://www.yumpu.com/en/document/read/6532...lica-watches-uk
https://online.flippingbook.com/view/152275247/
https://www.instapaper.com/p/8767342
https://www.bigblueview.com/users/Replicarolexwatches
https://weheartit.com/watcheshutuk
https://sites.google.com/view/replicarolexwatches24/home
https://www.indiehackers.com/post/hints-on-...atch-113aef73a9
http://replicawatchesuk.esportsify.com/for...ica-rolex-watch

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Софт · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 29.03.24 04:50
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft