Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
jelenarus |
То есть, раз ДНК амплифицируется, значит нужная есть, хотя бы исходная плазмида должна быть, но на сиквенсах совсем не то! |
ship Постоянный участник Moscow |
(jelenarus @ 26.04.2018 16:04) Проблема в Вас! Ну зачем все эти скрининги с ПЦР? У вас что 1 правильный клон из 100 получается? Порежьте плазмиду 2-3 комбинациями рестриктаз и посмотрите соответсвует ли паттерн фрагментов ожидаемому. И если сиквенс вы сами делаете - то ничего удивительного в том что там какаято фигня. Отдайте тем кто делает это на потоке, типа ЦКП геном. И когда такие вопросы задаете то давайте информацию о том, что и как вы делаете, картинки прицепляйте. Не зря говорят, правильно заданный вопрос уже половина ответа на него. |
R-J-Dio Постоянный участник |
Предыдущий оратор не прав на 100 %- правильно поставленный скрининг ПЦРом- это очень быстро, информативно и позволяет минимизировать число выделяемых плазмид, к тому же рестрикциию поставить дольше и дороже, чем ПЦР, так что тут все ОК, но надо понять, что именно у Вас не так |
ship Постоянный участник Moscow |
(R-J-Dio @ 26.04.2018 17:08) Предыдущий оратор не прав на 100 %- правильно поставленный скрининг ПЦРом- это очень быстро, информативно и позволяет минимизировать число выделяемых плазмид, к тому же рестрикциию поставить дольше и дороже, чем ПЦР, так что тут все ОК, но надо понять, что именно у Вас не так если делать однообразное клонирование в стандартный вектор, для которого есть пара опять же стандартных праймеров, то может и да. и, повторю , если ожидается один клон из 100. то да -это ПЦР. рестрикция дороже? смотря чем резать. ПЦР быстрее? я могу поставить рестрикцию быстрее чем вы ПЦР. А если куча разных клонирований? что праймеры синтезировать для каждого скринига? ведь не всегда можно взять M13F-M13R.
|
R-J-Dio Постоянный участник |
|
ship Постоянный участник Moscow |
(R-J-Dio @ 26.04.2018 19:45) во-первых, для рестрикции нужна плазмида, стало быть, день потерян. во-вторых, скрининг можно ставить и с ген-специф. праймеров, надо просто понимать про контроль и кол-во циклов, к тому ж праймеры векторные и для сиквенса понадобятся, их все равно делать. в -десятых, векторов небесконечно много, очень скоро такая коллекция праймеров на все случаи скопится, что проблем не будет никаких. не спорьте, у меня таких ситуаций сотня в год, я уж сто пудов лучше знаю, о чем говорю, просто по роду деятельности нет, буду спорить. у меня такой же род деятельности и плазмид собрал тысячи и занимаюсь этим постоянно. и день как раз таки не теряется а наооборот, если выделить плазмиду - то сразу можно ее резать и клонировать дальше, когда идет сборка сложных геномных конструкций. и вообще. я говорил что им надо было плазмиду готовую порезать и проверить, прежде чем на сиквенс отдавать. ибо непонятно что они там наПЦРили в своем скрининге. Сообщение было отредактировано ship - 26.04.2018 22:09 |
R-J-Dio Постоянный участник |
(ship @ 26.04.2018 23:07) нет, буду спорить. у меня такой же род деятельности и плазмид собрал тысячи и занимаюсь этим постоянно. и день как раз таки не теряется а наооборот, если выделить плазмиду - то сразу можно ее резать и клонировать дальше, когда идет сборка сложных геномных конструкций. и вообще. я говорил что им надо было плазмиду готовую порезать и проверить, прежде чем на сиквенс отдавать. ибо непонятно что они там наПЦРили в своем скрининге. не будем меряться длиной... фрагмента. налицо спор остро-и тупоконечников. Боюсь, такие нюансы явно вне пределов понимания неофита, успешно решившего проблему с лЕгированием. если все сделано верно, то не суть, каким образом найден рекомбинатный клон, ПЦР-скриниггом или рестриктным анализом, тут иное дело. Заметьте. пока мы ту занимается методическими спорами, нуждающаяся (?) в совете особь так и не предоставила в студию иллюстацию своих проблем. Видимо, это нам надо с сиквенсами разобраться |
R-J-Dio Постоянный участник |
(Bern007 @ 27.04.2018 07:42) замена буквы понятна, у металлургов, к примеру, лЕгированные сплавы, вот им яндекс правописание и подсказал.
|
jelenarus |
(R-J-Dio @ 27.04.2018 12:41) не будем меряться длиной... фрагмента. налицо спор остро-и тупоконечников. Боюсь, такие нюансы явно вне пределов понимания неофита, успешно решившего проблему с лЕгированием. если все сделано верно, то не суть, каким образом найден рекомбинатный клон, ПЦР-скриниггом или рестриктным анализом, тут иное дело. Заметьте. пока мы ту занимается методическими спорами, нуждающаяся (?) в совете особь так и не предоставила в студию иллюстацию своих проблем. Видимо, это нам надо с сиквенсами разобраться Спасибо за ответы) То, что слово «лигирование» произошло от «лигазы» я в курсе, это всего лишь опечатка) И да, извините студента, не всегда все понимаю с первого раза Сейчас постараюсь разъяснить Мы собираем плазмиду, в конечном итоге нужно залигировать саму на себя по тупым концам, для этого мы используем фосфорилиоованные праймеры (либо просто фосорилируем ДНК после рестрикции), далее лигируем с помощью T4 Ligase или Blunt Mix, затем выросшие колонии мы скринируем (ставим ПЦР, часть колонии наносим полоской на чашки, оставшиеся на наконечнике клетки помещаем в ПЦР смесь), потом естественно форез и по результатам Фореза берём прошедшие скрининг ДНК и ставим на секвенирование. Собственно чистим exosap’ом, а затем по вот этому протоколу(фото, извините за почерк). Используем bigdye 1.1 А по итогу в программе snapgene мы обнаруживаем совершенно непонятные сиквенсы... Картинки: 3ACE7339_B98D_4C82_9276_9B84191AF65C.jpeg — (2.25мб) 16D86698_CE1F_4FB1_B2E0_EFD245460C27.jpeg — (2.37мб) |
ship Постоянный участник Moscow |
Вы зашиваете саму на себя плазмиду после рестрикции или после ПЦР? чем режете? или что ПЦРите? ничего не понятно. разберитесь что и как вы делаете. и подробно напишите. а еще лучше опишите конечную цель работы. |
R-J-Dio Постоянный участник |
процедура скрининга ваще улыбнула, как левой пяткой правое ухо чесать! Далее как это" фосорилируем ДНК после рестрикции". а разве после рестрикции фосфатов нет? И вообще, ничего не понял, давайте, вторая попытка объяснить высокой публике, что у вас там за чертовщина. |
Carbon Copy Постоянный участник So close no matter how far |
(jelenarus @ 27.04.2018 16:07) ...А по итогу в программе snapgene мы обнаруживаем совершенно непонятные сиквенсы... Сиквенсы непонятными не бывают. Они либо бывают, либо нет. В этом и состоит красота ДНК секвенирования, что не существыет "серой зоны", свободной для интерпретации. Если что-то отсеквенировалось, то это со 100% вероятностью свидетельствует о присуттствии ДНК матрицы. Поэтому, если вы получили сиквенсы, не соответствующие Вашим ожиданиям, то дело не в сиквенсах, а в Вас. |
R-J-Dio Постоянный участник |
|
R-J-Dio Постоянный участник |
|
sceptique Постоянный участник временной жизни |
Поучите идите жену на кухню. Теоретик несостоявшийся. Чем проще и понятнее высказывание, тем ближе оно к истине. Привыкли занаучивать всё простое, чтобы заметать следы своего вечного безсилия что-то правильно обобщить... |
R-J-Dio Постоянный участник |
|
sceptique Постоянный участник временной жизни |
|
ksm Постоянный участник |
(sceptique @ 10.05.2018 15:34) Я сторонник дореволюционной русской грамматики, если это не официальная переписка с теми, кто только новую грамматику признаёт. Вам тоже советую с ней ознакомиться, чтобы быть менее категоричным в своих информированных субъективных оценках. тогда уж писали бы "безсилie" |
Fledermaus |
Если я правильно поняла, то вы делаете пцр колоний. Отжиг при 50 градусах не вполне специфичен, на мой взгляд. Вообще схема пцр довольно странно выглядит , не знаю, какая полимераза, просто свертесь с протоколом производителя. Ну и из за вероятной неспецифичности отжига, проверте наличие бандов у нетрансформированных колоний (пардон, конечно, но и такое бывает), и действительно , порежте пцр продукт. |
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |