molbiol.ru -> Что с сиквенсами?

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Что с сиквенсами?

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

jelenarus

26.04.2018 18:04

URL #1

Добрый день) мы собираем плазмиду. Все идёт хорошо, решили проблему с легированием, бактерии на чашках растут, потом ставим скрининг ПЦР , тут тоже все отлично, амплифицируется нужный Бенд. Затем ставим секвенирование, а там какая-то фигня. И даже не исходная плазмида! А правда фигня! В чем может быть проблема?
То есть, раз ДНК амплифицируется, значит нужная есть, хотя бы исходная плазмида должна быть, но на сиквенсах совсем не то!

ship
Постоянный участник
Moscow

26.04.2018 18:52

URL #2

(jelenarus @ 26.04.2018 16:04)

В чем может быть проблема?

Проблема в Вас!

Ну зачем все эти скрининги с ПЦР? У вас что 1 правильный клон из 100 получается?
Порежьте плазмиду 2-3 комбинациями рестриктаз и посмотрите соответсвует ли паттерн фрагментов ожидаемому.
И если сиквенс вы сами делаете - то ничего удивительного в том что там какаято фигня. Отдайте
тем кто делает это на потоке, типа ЦКП геном.
И когда такие вопросы задаете то давайте информацию о том, что и как вы делаете, картинки прицепляйте.
Не зря говорят, правильно заданный вопрос уже половина ответа на него.

R-J-Dio
Постоянный участник

26.04.2018 19:08

URL #3

давайте так. опускаю ваши многочисленные жаргонизмы через слово, режет глаз, но терпеть можно. Но слово "фигня"- это ни о чем. Если Вы хотите совета, а не эмоций, аттачьте хроматограммы, скажите, что в них не так- плохие пики, не тот сиквенс, что-то еще? Возможно, что-то со скринингом (не с тех праймеров), и в результате Вы читаете не то, что надо или что ожидаете прочесть
Предыдущий оратор не прав на 100 %- правильно поставленный скрининг ПЦРом- это очень быстро, информативно и позволяет минимизировать число выделяемых плазмид, к тому же рестрикциию поставить дольше и дороже, чем ПЦР, так что тут все ОК, но надо понять, что именно у Вас не так

ship
Постоянный участник
Moscow

26.04.2018 19:51

URL #4

(R-J-Dio @ 26.04.2018 17:08)

Предыдущий оратор не прав на 100 %- правильно поставленный скрининг ПЦРом- это очень быстро, информативно и позволяет минимизировать число выделяемых плазмид, к тому же рестрикциию поставить дольше и дороже, чем ПЦР, так что тут все ОК, но надо понять, что именно у Вас не так

если делать однообразное клонирование в стандартный вектор, для которого есть пара опять же стандартных праймеров, то может и да.
и, повторю , если ожидается один клон из 100. то да -это ПЦР.

рестрикция дороже? смотря чем резать.
ПЦР быстрее? я могу поставить рестрикцию быстрее чем вы ПЦР.
А если куча разных клонирований? что праймеры синтезировать для каждого скринига? ведь не всегда можно взять M13F-M13R.

Поблагодарили (1): jelenarus

R-J-Dio
Постоянный участник

26.04.2018 21:45

URL #5

во-первых, для рестрикции нужна плазмида, стало быть, день потерян. во-вторых, скрининг можно ставить и с ген-специф. праймеров, надо просто понимать про контроль и кол-во циклов, к тому ж праймеры векторные и для сиквенса понадобятся, их все равно делать. в -десятых, векторов небесконечно много, очень скоро такая коллекция праймеров на все случаи скопится, что проблем не будет никаких. не спорьте, у меня таких ситуаций сотня в год, я уж сто пудов лучше знаю, о чем говорю, просто по роду деятельности

ship
Постоянный участник
Moscow

26.04.2018 22:07

URL #6

(R-J-Dio @ 26.04.2018 19:45)

нет, буду спорить. у меня такой же род деятельности и плазмид собрал тысячи и занимаюсь этим постоянно. и день как раз таки не теряется а наооборот, если выделить плазмиду - то сразу можно ее резать и клонировать дальше, когда идет сборка сложных геномных конструкций.

и вообще. я говорил что им надо было плазмиду готовую порезать и проверить, прежде чем на сиквенс отдавать. ибо непонятно что они там наПЦРили в своем скрининге.

Сообщение было отредактировано ship - 26.04.2018 22:09

R-J-Dio
Постоянный участник

27.04.2018 11:41

URL #7

(ship @ 26.04.2018 23:07)

не будем меряться длиной... фрагмента. налицо спор остро-и тупоконечников. Боюсь, такие нюансы явно вне пределов понимания неофита, успешно решившего проблему с лЕгированием. если все сделано верно, то не суть, каким образом найден рекомбинатный клон, ПЦР-скриниггом или рестриктным анализом, тут иное дело. Заметьте. пока мы ту занимается методическими спорами, нуждающаяся (?) в совете особь так и не предоставила в студию иллюстацию своих проблем. Видимо, это нам надо с сиквенсами разобраться

R-J-Dio
Постоянный участник

27.04.2018 11:44

URL #8

(Bern007 @ 27.04.2018 07:42)

решили проблему с легированием

лИгировать от слова лигаза

замена буквы понятна, у металлургов, к примеру, лЕгированные сплавы, вот им яндекс правописание и подсказал.

Поблагодарили (1): jelenarus

jelenarus

27.04.2018 18:07

URL #9

(R-J-Dio @ 27.04.2018 12:41)

Спасибо за ответы)
То, что слово «лигирование» произошло от «лигазы» я в курсе, это всего лишь опечатка)
И да, извините студента, не всегда все понимаю с первого раза
Сейчас постараюсь разъяснить
Мы собираем плазмиду, в конечном итоге нужно залигировать саму на себя по тупым концам, для этого мы используем фосфорилиоованные праймеры (либо просто фосорилируем ДНК после рестрикции), далее лигируем с помощью T4 Ligase или Blunt Mix, затем выросшие колонии мы скринируем (ставим ПЦР, часть колонии наносим полоской на чашки, оставшиеся на наконечнике клетки помещаем в ПЦР смесь), потом естественно форез и по результатам Фореза берём прошедшие скрининг ДНК и ставим на секвенирование.
Собственно чистим exosap’ом, а затем по вот этому протоколу(фото, извините за почерк). Используем bigdye 1.1
А по итогу в программе snapgene мы обнаруживаем совершенно непонятные сиквенсы...

Картинки:

3ACE7339_B98D_4C82_9276_9B84191AF65C.jpeg — (2.25мб)

16D86698_CE1F_4FB1_B2E0_EFD245460C27.jpeg — (2.37мб)

ship
Постоянный участник
Moscow

27.04.2018 19:39

URL #10

ПЦР 5 секунд отжиг и 4 мин элонгация?

Вы зашиваете саму на себя плазмиду после рестрикции или после ПЦР? чем режете? или что ПЦРите?
ничего не понятно. разберитесь что и как вы делаете. и подробно напишите.
а еще лучше опишите конечную цель работы.

R-J-Dio
Постоянный участник

27.04.2018 21:07

URL #11

кошмар. каждая строчка содержит ну, не ошибки, нет, но такие субоптимальные условия, что как при перемножении вероятностей, на выходе дает (может дать) голимый хрен. последняя строчка- переосаждение изопропом, ваще улет. Я так не делал уже лет 25, -20 на ночь! Мой бог, ЗАЧЕМ!!!!!!!!!!!!!!!!?????????И где соль 0.1 объема? и вообще, кто у вас супервайзор, я бы придушил нахер! портит человека, если уже не испортил.

процедура скрининга ваще улыбнула, как левой пяткой правое ухо чесать!

Далее
как это" фосорилируем ДНК после рестрикции". а разве после рестрикции фосфатов нет?
И вообще, ничего не понял, давайте, вторая попытка объяснить высокой публике, что у вас там за чертовщина.

Carbon Copy
Постоянный участник
So close no matter how far

27.04.2018 23:29

URL #12

(jelenarus @ 27.04.2018 16:07)

...А по итогу в программе snapgene мы обнаруживаем совершенно непонятные сиквенсы...

Сиквенсы непонятными не бывают. Они либо бывают, либо нет. В этом и состоит красота ДНК секвенирования, что не существыет "серой зоны", свободной для интерпретации. Если что-то отсеквенировалось, то это со 100% вероятностью свидетельствует о присуттствии ДНК матрицы. Поэтому, если вы получили сиквенсы, не соответствующие Вашим ожиданиям, то дело не в сиквенсах, а в Вас.

R-J-Dio
Постоянный участник

28.04.2018 08:00

URL #13

очень даже бывают места, допускающие 100500 толкований, о чем вы ваще, как пионэр, блин?!

R-J-Dio
Постоянный участник

04.05.2018 16:18

URL #14

да ладно, так далеко ходить. каждый божий день с таким сталкиваешься при банальном контрольном секвенировании ген. конструкций, никаких de novo seqs. Чем категоричнее высказывание, чем шире обощение, тем дальше оно от истины. запишите и выучите наизусть

sceptique
Постоянный участник
временной жизни

09.05.2018 19:50

URL #15

> запишите и выучите наизусть
Поучите идите жену на кухню. Теоретик несостоявшийся.

Чем проще и понятнее высказывание, тем ближе оно к истине. Привыкли занаучивать всё простое, чтобы заметать следы своего вечного безсилия что-то правильно обобщить...

R-J-Dio
Постоянный участник

10.05.2018 01:01

URL #16

"безсилия"...грамотей, блин...

sceptique
Постоянный участник
временной жизни

10.05.2018 14:34

URL #17

Я сторонник дореволюционной русской грамматики, если это не официальная переписка с теми, кто только новую грамматику признаёт. Вам тоже советую с ней ознакомиться, чтобы быть менее категоричным в своих информированных субъективных оценках.

https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%A0%D1%83%...%84%D0%B8%D1%8F

ksm
Постоянный участник

10.05.2018 20:26

URL #18

(sceptique @ 10.05.2018 15:34)

тогда уж писали бы "безсилie"

Fledermaus

18.05.2018 00:14

URL #19

Мде, года два не заходила, ничего и не изменилось. Все переросло в мелочные придирки и грамматические разборки. Jelenarus, не поленитесь, напишите, пожалуйста, в чем там дело было.
Если я правильно поняла, то вы делаете пцр колоний. Отжиг при 50 градусах не вполне специфичен, на мой взгляд. Вообще схема пцр довольно странно выглядит , не знаю, какая полимераза, просто свертесь с протоколом производителя. Ну и из за вероятной неспецифичности отжига, проверте наличие бандов у нетрансформированных колоний (пардон, конечно, но и такое бывает), и действительно , порежте пцр продукт.

watchesbiz
Постоянный участник

20.11.2021 17:54

URL #20

https://www.uptrennd.com/post-detail/hints-...-watch~ODY3MDU2
https://anotepad.com/note/read/mqg8p5jm
https://www.crokes.com/replicarolexwatches/profile/
https://ko-fi.com/post/Watches-Shopping-Gui...-Watc-E1E13PZV9
https://www.merchantcircle.com/blogs/replic...x-Watch/1966540
https://www.nairaland.com/6427528/watches-s...de-finding-fake
https://www.vingle.net/posts/3587193
https://fortunetelleroracle.com/sport/replica-watches-280478
https://www.goodreads.com/story/show/132736...ake-rolex-watch
https://www.diigo.com/item/note/85twz/phwr?...2395edb2dac07ea
https://github.com/ReplicawatchesUK/Replica...ake-Rolex-Watch
https://www.reddit.com/user/Bestreplicawatc...ke_rolex_watch/
https://slashdot.org/submission/13306958/wa...ake-rolex-watch
https://www.wattpad.com/1030107359-replica-...guide-finding-a
https://www.instructables.com/member/Fakero...licPreview=true

watchesonline89
Постоянный участник

26.12.2022 11:18

URL #21

https://telegra.ph/Advantages-Of-Replica-Watches-08-03
https://issuu.com/home/published/_6_.docx
https://www.gta5-mods.com/paintjobs/watchesswiss
https://omegawatches89.onweb.it/
https://padlet.com/omegawatches89/je3eq9ol3xzmb9bp
https://www.pinterest.com/omegawatches89/
https://knowyourmeme.com/users/omegawatches89
https://bitcointalk.org/index.php?topic=76487.new#new
https://omegawatches89.blog.hu/
https://knowyourmeme.com/forums/general/top...f-so-why?page=1
https://penzu.com/p/c6f21f5d
https://www.reddit.com/user/omegawatches89/...are_so_popular/
https://www.vingle.net/posts/4647076
https://penzu.com/p/c68b65cc
https://diigo.com/0pige9

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.