kglebov Постоянный участник Германия Гёттинген

15.08.2002 15:10                   URL #1 Добрый день, У нас тут не большая, а очень очень большая проблема... Есть омега-конотоксин, который метим Fluo Reporter Tetramethylrhoodamine Protein Labelin Kit (F6163) фирма Molecular Probes в результате получаем 200 микролитров продукта. А вот как его очистить от свободного Tetramethylrhoodamine? пробовали разные методы, но вся проблема в том, что размер конотоксина 3000 а красителя 500 = наш комплекс имеет размер 3500. Разница очень маленькая и образца очень мало... Может кто знает как решить проблему..... Большое спасибо..... <img src="graemlins/shuffle.gif" border="0" alt="[смущение]" /> [Текст переведён с транслита]

avor moderator

15.08.2002 15:53                   URL #2 Могу сказать только общие слова. Придется Вам ребята освоить хроматографию HPLC на обратной фазе. Совет первый: почитайте CA на эту тему желательно найти статью о выделении и очистке этого токсина или статью в хроматографическом журнале. Сходите к своим хроматографистам может они уже чего знают по теме. А так на вскидку: неподвижная фаза С8, подвижная градиент вода-метанол ну процентов до 60 метанола. Первым должен выйти непрореагироваший токсин потом гребенка родаминовых производных и последний непрореагировавший родамин. Это если токсин пептид и препарат не валялся долго в буфере(в этом случае появится еще и гидролизованный активнрованный родамин). Но это общий такой подход, а может есть что попроще. А еще двойная аффинка одна на АТ к родамину, а другая к токсину(это так просто идея)

kglebov Постоянный участник Германия Гёттинген

15.08.2002 16:05                   URL #3 TO: Avor А можно по подробнее про второй метод. А то я в этом во всем не очень хорошо разбираюсь. Да, конотоксин это пептид. Пойти не к кому (отпуска), а надо чистый продукт чем скорее, тем лучше... А как ее эту двойную аффинку то поставить, я если правильно понимаю, то надо сделать "резину" специфическую, которая связывается с родамином а вторая с токсином. А как их сделать... Я конечно прошу прощения за столь тупые вопросы, но я очень редко занимался хромотографией... А А что делать с малым количеством образца??? [Текст переведён с транслита]

Tom Участник

15.08.2002 16:50                   URL #4 Как насчет Ц-8 не знау а вот Ц-18 точно могно использовать АТ это антитела... и ы предпочитау в качестве подвигнои фазы вода азетонитрил П.С. емаил мои дошел????? Том [Текст переведён с транслита]

kglebov Постоянный участник Германия Гёттинген

15.08.2002 17:12                   URL #5 To: Tom Спасибо, а как тогда сделать этот Ц-18, ведь если его просто насыпать и прогнать образец толку не будет. Если можно то по подробнее... А какой емаил? Про АТ, а не будут ли эти АТ спец. к родамину или токсину связываться и с комплексом родамин-токсин? Ведь там же эти молекулы тоже есть, они только связаны вместе? PS: в Molecular Probes предложили сделать диализ, что Вы по этому поводу думаете? [Текст переведён с транслита]

avor moderator

15.08.2002 17:26                   URL #6 Да, блин, говорю, что плохо все это. За 5 мин не сделаешь. Что бы колонки сделать надо антитела иметь на то и другое. АТ надо купить это быстро(но сдается мне, дико дорого, $300-500 за мульку), а если получать в кролике самому, это месяц уйдет и не факт, что получится, тоже надо опыт иметь в такой работе. Затем пришиться. Наиболее отработанные методы это BrCN-sepharose, эпокси-сефароза, и перодатный метод. Из простого могу посоветовать следующее: добавить в буфер этаноламина чтобы связать активный краситель и отдиализовать раствор на спец. мембране с отсечкой 1000 Да(такие бывают, дороже обычных, но доступны)при этом уйдет не связавшийся краситель. Теперь надо отделить непрореагироваший токсин от прореагировавшего. А может не надо? И этого хватит, ведь при радиоактивном мечении тоже остается некоторое кол-во молекул немеченных, и ничего. Но если очень хочется, то можно попробовать ионообменную хроматографию или изоэлектро фокусирование. По идее после обработки родамином +заряд белка должен уменьшится. Фокусирование - дороже, но во-первых наглядно( окрашенная зона), во вторых образец не разбавляется, а концентрируется, но потом опять диализовать. А вот гель при фокусировании лучше не использовать, лучше в схарозе или глицерине.

15.08.2002 17:30                   URL #7 Когда-то я птался чистить диализом белок от несвиазавшегося ФИТЦ. Использовал диализние мембрани Серва. Ничего толкового из этого не вишло. А почему би не попробовать гел-филтрацииу. Если использовать Г-15, то коньугат поидет во внеснем обьеме колонки и почти не разбавится, свободнии краситель - во внутреннем. Только колоночку взиать поменьше (около 2 мл) [Текст переведён с транслита] [Текст переведён с транслита]

kglebov Постоянный участник Германия Гёттинген

15.08.2002 17:35                   URL #8 To: Sergey Вот уже теплее, и у меня тоже была идея про гельфильтрацию... Если можно по подробнее... А вы ее сами пробовали (гельфильтрацию)? И если ей пользоваться, то у кого все это барахло купить лучще? [Текст переведён с транслита]

avor moderator

15.08.2002 17:42                   URL #9 Том стандарт говорит. А С-18 и С-8, они уже в готовом виде в колонке поставляются. Тебе только HPLC систему надо найти и чтоб ее user не в отпуске был. Но предупреждаю, что без конкретной методы можно весь образец потерять, или использовать микроаналитическую колонку для подбора условий хроматографии.

Sergi Участник SD, CA

15.08.2002 19:55                   URL #10 Все верно, если есть работающая HPLC, колонки, то проблем вообще никаких нет, тем более если количество неболшое (200 мкл мало о чем говорит). Если всего этого нет, то на мои взгляд затевать всу эту кухню вряд ли стоит. Да и дорого это. Гель-филтрацию я пробовал, все работало, выход был больше 90% (сколько точно не помню, хотя наити можно). Белок бил большои 130 kDa, так что использавал G-25. И есчо, я пытался это делать и на колонке с Toyopearl то ли HW-40, то ли HW-50, так ФИТЦ там сорбировался и не хотел вимиватся. Так что Sephadex оказался самим подходящим. [Текст переведён с транслита]

Sergi Участник SD, CA

15.08.2002 20:02                   URL #11 У кого заказать? Тут я совсем ничега сказать не могу. Sephadex точно мозшно купить у Sigmi, а я работал со старим, купленним у Pharmacia [Текст переведён с транслита]

Veshka Постоянный участник Москва

15.08.2002 20:11                     URL #12 Залезьте таки на Spectrum - там были искомые диализные мембраны со странными катоффами - 1000 и меньше. Но я бы, конечно, сделал RPC. Гель-фильтрация здесь, наверняка не поможет. Учитывая, особенно, что образца мало и упражняться не получится. И, конечно, С18, лучше всего на Symmetry300 или Xterra 2.1 narrowbore - лучше Waters такие колонки никто не делает. И пики на масспек. Тогда и 3000 от 3500 поделите и эффективность разом увидите. А если есть флюоресцентный детектор - вообще не работа . А как Вы думали - мы вот так и делаем с всякими пептидами...

Tom Участник

15.08.2002 22:36                   URL #13 Znachit tak sovershenno ne obyzatel'no dlya obraschenki imet' HPLC firma (lubimaya) Millipore prodaet ZipTip t.e. tvedaya faza v tipse -ochen' udobno. Gel-filtrachiya skoree vsego net moget -kritichen ob'em naneseniy, dolgo i razbavitsy obrazez da i potom vryadli mechennyi belok otdelitsya ot ne mechennogo. To: kglebov : Ya otravil e-mail s opisaniem varki epoxy-sepharozy i prishivke k nei belkov. Esli ne poluchil napishi na udod1@rambler.ru ili na rascal11@rambler.ru ili at2v@virginia.edu no vidimo luchshe na perviue dva. tom t.k. vidno servak v nashei Virginskoi derevne barahlit...

Andrei Постоянный участник

16.08.2002 01:50                   URL #14 Since you are in Germany, supposedly your lab has some money and can buy things. I see three ways of doing the separation: 1. Use small-scale gel-filtration. I have a Molecular Probes kit cat A10235 for labelling with Alexa Fluor which has three small columns and the resin you can pack in them. Call or e-mail Molecular Probes and ask what resin they will recommend ( I would use Sephadex G-15, could be purchased from Amersham/Pharmacia). Pack column with 2-3 ml of the resin and load 200 mkl of your sample. Then run the column and use small hand-held UV lamp ( turn the light in the coldroom off) to see what is going on. First you will see one bright red zone on the top of the column, then you will see two: the minor, fast-migrating and the major, slow-migrating. Collect fast-migrating (i.e. which will leave the column first)- it is your toxin labelled with TRITC. This method would not separate labelled from unlabelled toxin. The set-up for the column and elution is very simple and does nort require any special equipment or skills. The packing of the column should be described in Mol. Probes manual on theirs' Website. 2. Find FPLC or SmartSystem (Pharmacia machines for doing liquid chromatography) which have prepacked gel-filtration columns for peptide separation. Looking in the catalog, the columns are: Superdex HR 10/30 or PC 3.2/30. They have separation range 100-7000 daltons. Get help from people who knows how to use FPLC if you don't know. The gel filtration does not require a gradient so it's simple. If you cannot find column, you can buy it for $1000 or so. 3. In your institution or nearby should be some people who synthetize peptides and oligonucleotides. They, especially peptide folks, have HPLCs and are very experiences in separation of different kind of stuff. Moreover, as they are paid to synthetize peptides/oligos, they can be paid for separation of your toxin. This is probably the easiest way-if you have the money. They cauld also try , with the using of the reverse phase, to separate unlabelled from labelled toxin. [Текст переведён с транслита]

Sergi Участник SD, CA

16.08.2002 16:40                   URL #15 Еще вспомнил, мозно в пробу перед гел-филтрациеи добавить Трис или гидроксиламин (или просче уравновесить колонку трисовим буфером), которие прореагируиут с несвиазавшиимся красителем. Тогда, если мозшет и следи красителя после гел-филтрации будут некритични (если будете смотреть взаимодеиствие с помошиу микроскопа, а не флуориметра). [Текст переведён с транслита]

Sergi Участник SD, CA

16.08.2002 16:42                   URL #16 Еще вспомнил, мозно в пробу перед гел-филтрациеи добавить Трис или гидроксиламин (или просче уравновесить колонку трисовим буфером), которие прореагируиут с несвиазавшиимся красителем. Тогда, если мозшет и следи красителя после гел-филтрации будут некритични (если будете смотреть взаимодеиствие с помошиу микроскопа, а не флуориметра). [Текст переведён с транслита]

kglebov Постоянный участник Германия Гёттинген

17.08.2002 12:54                   URL #17 Всем спасибо, Прочитав все Ваши советы, а так же "забомбив" представительства Amersham и Molecular Probes буду делать следующим способом. Если что то не так, то пожалуйста поправьте... 1. сделать маленькую колоноку на 2-3 мл из Sepadex G-25 (разд. 1000 до 5000). А мои вещества имеют 500, 3000 и 3500. Или может лучше Sephadex G-15 (разд. до 1500)? 2. Уравновесить колонку трисом (вопрос какой концентрации и в чем, наверное в том же буфере, в чем и мои белки) 2-3 объемами... 3.Прогнать мой образец с использованием УВ (какой эл. буфер взять, и как получить большую концентрацию в маленьком объеме?) 4.Собрать фракции в разные пробирки... Все.. Если Вы можете проверить последовательность действий и ответить на мои вопросы. Буду очень признателен.... [Текст переведён с транслита]

Tom Участник

17.08.2002 16:22                   URL #18 To: kglebov I'm not think so...

kglebov Постоянный участник Германия Гёттинген

17.08.2002 17:29                   URL #19 To: Tom Если Вас что-то смущает, поделитесь своими соображениями... Да, письма от Вас не было..... [Текст переведён с транслита]

Andrei Постоянный участник

17.08.2002 23:52                   URL #20 To kglebov, Your plan sounds good. Minor suggestions: - you would not separate 3000 from 3500 by gel filtration on any column. Just take G-15, it will allow you to separate unbound dye from toxin. - You can use any buffer for GF, avoid detergents (TX-100 or so). Just equilibrate it with 4-5 volumes of the buffer your will need at the next step. Keep in mind that the toxin would be exchanged into the column buffer so it does not matter in what buffer is the toxin BEFORE loading onto the GF column. It also does not matter what "elution buffer" to use because the toxin will be exchanged into the column buffer. - The sample would be diluted at least 3-fold, most probably 4-5 fold. Keep this in mind. What I did-I used the hand-held UV lamp and when the labelled protein began to exit, collected it. One Eppendorf tube was enough. But do not collect the major, slow-migrating fluorescent peak together with the fast one!! - You may try to concentrate the sample with a microconcentrator such as Microcon but the toxin is low MW and I am not sure such concentrators are available. If you desperately need to concentrate your sample after GF, you can use SpeedVac. Do not turn on heat; the toxin shoud be stable enough to survive one hour or so at the RT. In this case, be sure you are using low-molarity buffer because salts will also be concentrated. Good luck! Andrei [Текст переведён с транслита]

Sergi Участник SD, CA

18.08.2002 07:00                   URL #21 Есчо паре дополнении я би взиал колонку с соотношением диаметр/длина=1/10 - 1/15, в этом случае разбавление будет меньше (но в 3 раза всио равно разбавитсиа). Только с такои колонкои стоит брать только G-15, на G-25 всио размазшется и толком не почистится (для него колонка нузшна длинее, но и разбавление будет значительно болше). Трис прореагирует с несвиазавшимся красителен еквимолиарно, так что лучше взиать его в небольшом избитке. pH - как при коньугации с токсином (казшется обично 8-9). Только нузшно помнить, Andrey сказал про это, если ви уравновесите этим буфером колонку, то в нем зше и получите токсин. Если это вас не устраивает, мозшет просче добавить Трис в пробу, а делить узе после. Удачи! [Текст переведён с транслита]

ALT Постоянный участник

18.08.2002 20:16                   URL #22 Ух, я может и зря ввязываюсь, но вот совет, не возится с колонками. В любом случае размывания и долгая отладка. Лучше взять и зделать все на ТСХ. Если взять хорошие пластинки, то растащить это не проблема, и на отладку уйдет очень и очень мало образца и времени. Да и технически это очень просто. Разбавляете свой образец рац в дцать (не весь конечно, а скажем 0,5мкл) подбираете систему растворителей. Далее наносите полосой, потом экстрагируете с носителя. При отладке, конъюгат и и родаминовые производные смотрите по флуоресценции, свободный пепт, красите нингидрином. На всю операцию при наличии пластинок - два дня от силы. С практически 100% гарантией. А если хочется на колонке, то рекомендую контрол пор гласс, если по размеру. Соотношение диаметр/длина для разделительной гельфильтрации не менее 1/20, а лучше 1/50 и для такой задачи объем образца к объему колонки - 1/50 это минимум. Кстати Вы уверены, что там только один конъюгат. Если в последовательности есть лизин, аргинин, то их уже больше, а вообще с такими производными могут реагировать и другие аминокислоты по боковым радикалам. А каждый родамин увеличивает массу на 500, так что не обольщайтесь увидеть там три пика. Хотя я конечно не знаю последовательность и может все не так печально.

Sergi Участник SD, CA

18.08.2002 20:32                   URL #23 то АЛТ Если разделять коньюгаты, то безусловно гель-фильтрация неэффективна. Если же просто отделить свободныи краситель, то классическая гель-филтрация и не нужна, более того, явно вредна. На колонке 1/50 забитои G-15 весь токсин (и связавшиися с родамином и не связавшиися) поидет во внешнем обьеме, следовательно делиться не будет, родамин - во внутреннем, след-но отделится от токсина. В этом случае 1/15 вполне достаточно. А при 1/50 разбавление будет такое, что деиствительно лучше просто и не пытаться. [Текст переведён с транслита]

avor moderator

19.08.2002 11:02                   URL #24 2glebov. Из всего полезного что тут сказали. Могу заметить, важно то, что: коньюгат токсина может содержать не одно модекулу красителя. ТСХ можно использовать для подбора системы, но на ней сложно делать градиент конц. элюэнта раз и сложно делать препаративку, а потом соскр*** сорбент и элюировать продукт с сорбента. Вместо триса для связывания активных групп красителя можно использовать этаноламин(что я уже говорил), диэтаноламин, глицин, и даже карбонаты аммония(но это не очень проверено). Для концентрации образца можно использовать не только, speedvac, но и лиофильную сушку. Слабая соль при гель фильтрации мрожет способствовать неспецифической сорбции на сефадексе. Чтобы соль при концентрировании образца на speedvacе или лиофилкой не концентрировалась можно использовать летучие буферы для гель фильтрации(карбонат и бикарбонат аммония, карбонат и бикорбанат триэтиламмония, а так же их ацетаты и формиаты ) выбор зависит от оптимального pH. В G25 предел исключения 5000 это значит что токсин выйдет не в свободном объеме, но верняк раньше красителя, производные пептида и пептида на ней врядли поделятся (малая эффективность колонки), но теоретически на длинной колонке може че и получится(надо брать порошок superfine). В G15 предел исключения 1500 это как раз для отделения несвязавшегося красителя. Посоветованный Tom картридж с RP-сорбентом в сочетании с подбором условий на ТСХ, предложенной ALT может оказаться простой и дешевой альтернативой гельфильтрации и HPLC, тк при удачном подборе системы, К сорбции разделяемых компонентов будут достаточно различны, что бы с высокой эффективностью использовать ступенчатый градиент на картридже. Но главное здесь идентичность сойств сорбента на ТСХ пластине и в картридже. Поэтому этот вопрос нужно согласовывать с фирмами, фактически не вероятно использовать пластины ТСХ одной фирмы, а картридж другой.

ALT Постоянный участник

19.08.2002 14:59                   URL #25 Для Avor, я думаю, что там градиент и не понадобится. Пептид не очень большой с блокированной (минимум одной) аминогруппой, с таким довеском, с одной стороны, и дезактивированный родамин с другой, мечта поэта. Это делится даже на обычном силикагеле в нормальнофазовой хроматографии. И не надо мудрствовать лукаво. Из своего опыта могу сказать, что силикагель не так сильно отличается по свойствам, как RP, кроме того найти нормальный RP выше 100 мкм - проблема. А иначе минимум FPLC, иначе не продавишь (ну можно конечно MMC взять, но это все от лукавого). А к картриджам я отношусь с сомнением, по крайней мере на российских много грязи и да и перенос условий трудоемок. Карбонат аммония малоэффективен, поскольку диссоциирован, а реакция проходит только в с депротонированными аминами, потому и слегка защелачивают. А аммоний чуть защелачишь и он превращается в газ, короче вонь одна. А вот этаноламин и глицин это хорошо, даже лучше триса, поскольку более нуклеофильны. При очистке это все уйдет. Для Sergi: я вообще не рассматривал G15, как вариант. Вопрос ведь стоит о разделении всех компонентов. А это уже не обессолка, так что длинная колонка и все "прелести" сефадекса.

Tom Участник

19.08.2002 15:56                   URL #26 То all: Вот стоит не придти на работы в выходные и уге столько понаписали... В чем-то согласен с ALT могет в данном случае ТШ и один из луцших вариантов. Что касаемо советов г-на Андрея ( демонстрируусчего тут всое знание языка а не практическои раборы) то видно что читал он то много а раборал видно маловато... Sergi если уг горотит только о обессаливании тогда что огород городить покупаешь PD-10 или аналог и никаких Али-бабов.. ALT дык почему ия и писал что скорее всего обратная фаза луцчше всег будет. То: kglebov: понял сегодня повторно отправлу мыло. [Текст переведён с транслита]

19.08.2002 17:11                   URL #27 to kglebov не сочтите за занудство, но я бы, между п2 и п3 поставил бы пункт калибровки колонки, какая у вас случится. Это не очень долго, но зато, вы о ней узнаете "все". Если вы таки остановились на size exclusion здесь это названо гель-фильтрацией, то прогоните несколько PEGов c разными Mr, ну скажем 0.2К, 0.4К, 1К, 3К, 5К ну и 10К. Сами прогоны на вашей колонке займут минуты. Максимальное время конечно пойдет буфер, какой вы выберете для injected sample. Если не влом, постройте после этого график Log[Mr] к retention time. Это и будет вашей калибровкой. Вы узнаете что, когда, какого размера из вашей колонки выходит. Конечно радиус exclusion volume полимерного клубка и Mr это не одно и то же, но на эти детали, вам, наверно не стоит обращать внимание. Теперь, вы легко оцените по планируемым Mr ваших компонентов что и когда выйдет, и даже как сильно ожидать перекрывание пиков. Теперь сделайте отдельно прогон краситель, отдельно омега-конотоксин, вы узнаете насколько правы в своих ожиданиях. После этого попробуйте ваш п3. примечание1: конечно вы будете работать на HPLC, так что фиксируйте спектр UV, это займет много памяти но себя оправдает при расшифровке, и разумеется пишите RID сигнал он тоже полезен особенно если буфер и элюент разные, и к тому же есть маленький компонент. примечание2: на той же гель-фильтрации может случится как и size exclusion так и adsorption хроматографии. Все будет зависеть от конкретного сочетания элюент-задерживающая среда-молекула. Коллеги, ожидают что будет size exlusion, однако, если вы заметите, что ваши вещества, какие я вам советовал прогнать по отдельности, выходят ПОЗЖЕ буфера, то вы сидите в adsorption моде, а там разделение по размерам не работает.

Sergi Участник SD, CA

19.08.2002 17:48                   URL #28 No vopros to zadan vpolne konkretno:"А вот как его [product] очистить от свободного Tetramethylrhoodamine?" Vrode avtora interesovalo tol'ko eto. A tut obessolki vpolne dostatocno (kak mne kazshetsia))

ALT Постоянный участник

19.08.2002 18:37                   URL #29 Для www: у Вас пожалуй самый сложный, размытый и ни очем не говорящий ответ. Для Sergi, иногда вопрос сформулирован не совсем четко, по сути отделить реагент не проблема, а вот не прореагировавший пепт, задачка более интересная, а если обессолка, то самый плотный сорбент и первый окрашенный банд, а при таком объеме образца я бы в наконечнике сделал на фуге, три минуты страус пойман. Для ТОММ, все таки по моему обращенка слегка крутовато, пойдес и обычный силикагель, если только пантами не трясти, дешево и сердито.

Tom Участник

19.08.2002 21:20                   URL #30 То: ALT Могет быть и поидет. Только чем ге обратая круто?? Просто на силикагеле я думау дольше условий подбирать Тем более что на рецомендованых мноу колонках могно обходится без HPLC Том [Текст переведён с транслита]

Sergi Участник SD, CA

19.08.2002 21:43                   URL #31 Так и я о том же!!! Только точно решить надо ли разделять окрашенныи и неокрашенныи пептид может только kglebov. Тем более нужно ли разделять разные коньюгаты (не поленился, глянул в Сигме, там деиствительно есть два лизина в цепи)). Если нужно, то Вы абсолютно правы, нужно связываться с ТСХ или HPLC (тут я ничего сказать не могу, сам с ними никогда не работал), если же нет, то зачем выбирать сложную и дорогую HPLC, если можно решить все проще (HPLC+анализ фракции на масс-спецтрометре совсем не простая задача, особенно если с этин никогда не работал). Так что теперь, наверное, выбор за автором вопроса. [Текст переведён с транслита]

kglebov Постоянный участник Германия Гёттинген

19.08.2002 21:48                   URL #32 Всем больщое спасибо, Но сегодня меня мое руководство обрадовало, купили специальную клонку за 1600 евро, которая все должна поделить.... Ещё раз всем спасибо. Думаю, что обязательно попробую все, про что здесь писали.... [Текст переведён с транслита]

Sergi Участник SD, CA

19.08.2002 21:54                   URL #33 Great! А что за специальная колонка, которая все делит. Теперь уже просто интересно. [Текст переведён с транслита]

kglebov Постоянный участник Германия Гёттинген

19.08.2002 22:02                   URL #34 Колонка называется Superdex Peptide Column HR10/30 от Amersham [Текст переведён с транслита]

Tom Участник

19.08.2002 22:17                   URL #35 То all: Ну естно купились на рекламу и купили колонку для фель-филтрасии... видно лишние купилки есть.. [Текст переведён с транслита]

kglebov Постоянный участник Германия Гёттинген

19.08.2002 22:47                   URL #36 А у них тут достаточно... И мне сказали, что это "круто" и все получиться с первого раза Ну а я что, хорошо говорю валяйте... А сам хочу посмотреть, что у них там получиться..... А потом, если из супер колонка облажается, предложить еще раз свои услуги. Вся проблема у немцев в том, что они "консервативные" (так называется их стиль работы, как мне рассказли).... Ну да ладно, потом расскажу что получилось.... [Текст переведён с транслита] [Текст переведён с транслита]

Andrei Постоянный участник

19.08.2002 23:19                   URL #37 To Tom, First, I think it is better to write in English than to use translit with "pearls" such as: "уг горотит", "луцчше всег", "раборал", "рецомендованых мноу" and so on, which I found in your postings. Maybe, better to install a Russian keyboard drivers or, if you don't have one, just write in English and don't abuse Russian language? Second, your recommendation to use PD-10 for this separation shows that it is you, my friend, who "читал он то много а раборал видно маловато..." Have you ever used PD-10? If you do, you should remember that the minimum realistic loading volume is 500 microliters and you will get minimum 3-fold dilution. kglebov has only 200 microliters, which he needs at the end as much concentrated as possible. PD-10 is not suited for working with such small volumes; if you have 200 mkl, you need to make your own thin and long column. But, what's worse, are you sure that PD-10 will separate labeled toxin from the unlabelled dye? PD-10 is packed with G-25, the exclusion volume for it is 5000 for GLOBULAR proteins ( according to Pharmacia's manual). Even if you consider the working range 1000-5000, as it is indicated in the manual for Sephadex G-25 resin, how you can be sure the toxin is globular? Use G-25 for this separation is not reliable, i.e. it may or may not work but if it does not work-you will have at the end the sample, diluted but not separated from the dye. Sephadex G-15, on the other hand, has a fractionation range less than 1500, and labeled toxin would exit in the void volume. So, nothing personal but...maybe it is better not to give advices on procedures you are not familiar with? [Текст переведён с транслита]

ALT Постоянный участник

20.08.2002 14:53                   URL #38 Ёкерный бабай, мне б такой стиль работы, когда из за 3 рублевой задачи тратят 1600 евро, круто, заплатите мне 1600 евро и я Вам десятка два конъюгатов, такого типа отчищу, да еще и по количеству родамина разделю, даже от дерьмицо уберу. Можно даже не деньгами, а реактивами и железом. Колонка конечно поделит, если конечно у FPLC-юзера в голове не вата, хотя судя по двум лизинам продукт будет не один. Кстати так не привычно читать Superdex от Amersham. Для ТОММ. обращенка круче потому, что С-18 и С8 силикагели в парашке это экзот, а простого силикагеля везде кучи, пошел и взял, да пластины с С-18 не так распространены, силуфола везде море. Исходя из этого и предсказание поведения гораздо проще на обычном силикагеле. Все его знают и любят, поэтому часто даже отладку делают на силуфоле, а потом берут пипетку засывают силикагелем и в той же системе, только в большем объеме. Увеличил длину в три раза и все получилось. С обращенкой так нельзя. Ну конечно можно, если денег куча, щелкнул пальцами и тебе супелковский сорбент через сутки притащили, ну или колонку, какую надо. Если HPLC видится только с MS, как у Sergi, это круто и стильно. Но мы люди простые и нищие, а поэтому силикагель 100/200 и силуфол. Два дня вместе с подготовкой и поехали дальше.

Tom Участник

20.08.2002 17:08                   URL #39 То: АЛТ Согласен но как видно купилок там много..... [Текст переведён с транслита] [Текст переведён с транслита] [Текст переведён с транслита]

Sergi Участник SD, CA

20.08.2002 18:52                   URL #40 to ALT: по поводу масс-спектра все вопросы к Veshka, это его идея ) Я же как раз говорю что это сложно и круто, но не больше [Текст переведён с транслита]

Sergi Участник SD, CA

20.08.2002 18:56                   URL #41 to ALT: по поводу масс-спектра все вопросы к Veshka, это его идея ) Я же как раз говорю что это сложно и круто, но не больше [Текст переведён с транслита]

ALT Постоянный участник

21.08.2002 04:54                   URL #42 Честно говоря я тут подумал на досуге и уперся в тупик. А в чем была проблема с 200 мкл. Я исходил из того, что бедным трудно купить дополнительный пепт и с родамином проблема. Но за 1600 евро можно было выйти на приличный объем и вообще разделить это кондовой экстракцией и не морочить голову.

avor moderator

21.08.2002 11:03                   URL #43 За 1600е можно было заказать меченный токсин на стороне без проблем.

kglebov Постоянный участник Германия Гёттинген

21.08.2002 13:31                   URL #44 Да я все прекрасно понимаю. Думаете я не говорил.... Ну что Вы, они же такие большие и умные... А конотоксин стоит около 700 евро за 50 микрограмм.... У нас тут есть "ОЧЕНЬ умный", ну а я так... Честно говоря меня уже достали эти методы работы по клише. В штатах такого не было.... [Текст переведён с транслита]

f1dark Постоянный участник Lahore, Punjab, Pakistan

01.10.2022 14:47                     URL #45 F1 Removal is a well known movers and packers company all over the UK. We have been working since 1980 providing professional moving services according to the need of the customers. We have highly trained staff for all sort of moving services during relocation. Removals Company | Removals Company in London | Office Removal in London | Office Removals London | Relocation Companies London | Removals Company in London | Moving Company in London | Moving Company | Movers in London | Man and Van in London | House Removals in London | House Removals | Packers and movers in London | Packers and movers London | Movers and Packers in London | Relocation Company in London | Commercial Removals | Local Movers | Long Distance Mover | Long Distance Movers | Long Distance Moving Company | renovations | london renovations | renovation companies in london | renovations company london | house renovation in london | Kitchen renovation london | Kitchen fitting london | Kitchen fitters in London | bathroom renovations london | painters and decorators in london | painting and decorating in london | painters in london | london decorators | vinyl tile flooring | vinyl flooring | laminate flooring | parquet flooring | wood flooring | parquet flooring london | luxury vinyl flooring | lvt flooring | wood flooring london | karndean flooring | herringbone flooring | laminate flooring london | amtico flooring | bathroom floor tiling | bathroom tiling | kitchen tiling | floor tiling | porcelain tiling | terrazzo tiling | painting and decorating leicester | painter and decorator ealing | painting and decorating brighton | local decorators

*	« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »