1. Пара праймеров близка к идеальной, но, правда, есть один селф-димер F-праймера, который можно устранить убрав концевой G и, соответственно, начальный G R-праймера для выравнивания Т пл.
2. В данном ките нет хот-старта (как можно такое продавать... ), так что "горбатого..." сами знаете, пардон.
3. Для GC-богатых праймеров (и матрицы M.tub) слишком низкая темп. отжига 56 град. Можете смело довести до 60-62 град и, к тому же, в составе смеси не вижу денатурирующих компонентов, снижающих Т пл. Или же все параметры остаются как есть, но добавляете в смесь ДМСО хотя бы до 5%.
4. Согласен с semi - рекомендую сократить вдвое время на элонгации.
пы сы: Картинки у Вас отвратительного качества, пардон.

Миксы сами варите, что за плашки, ПЦРник какой у Вас и сколько лет отработал и, наконец, какую программу для ПЦР используете, плавное затухание сигнала???? Всю эту инфу прошу в студию!
Я тоже склоняюсь к тому, что сказал dk - термоблок "чудит", т.е. работает на грани. У других проходит - значит, программа у них с запасом по времени, а у Вас на грани, балансируете со своим генотипированием и зондами в одной пробирке.
Совет мой - добавьте для каждой температуры еще по 20 сек, а на денатурации доведите температуру до 95-96. Если все пойдет нормально на такой программе, везите прибор на починку. Дело только в нем (сказал он с умным выражением лица).

Смело берите 0,5-1,0 % PVP и все будет ОК. По значимости из компонентов буфера PVP на последнем месте. Там SDS работает.

Биканами не увлекаюсь на данный момент, они мне не понравились в свое время. Они любят инд.подход.
Я простыми ТакМанами с контактным тушением, чтобы на простом флуориметре тоже можно было регистрировать сигнал, с минимальным фоном.

35 лет назад сказал бы - это же чудо, волшебники какие!
А сейчас этим хвастаться - себя не уважать.
РНК хоть научились выделять или все по буму?
Каждый второй результат - ложный, позорище! А если смешанная инфекция, к примеру, 1 к 1000?

Купите агарозный минифорез, стандартную ДНК фага Лямбда с известной точной концентрацией и вперед и вверх, как говорит всегда мой друг Генсек.

[quote=DimVik,19.01.2021 05:52]  [quote=-Ъ-,14.01.2021 18:38]  В STR идентификации конечно нужно знать сколько добавлять ДНК в реакционную пробирку (достаточно 1-10 нг для рутинных работ). Когда-то я выбирал эти самые STR праймеры для лошадей и КРС.
По поводу праймеров для КРС и Лошадей! Вот это экстремально интересная информация. Как воздух нужна. Изыскиваем в научных статьях. Но некоторые при проверке оказываются кривые. Да и уровень знаний пока что не позволяет разобраться в тонкостях. Особенно как к примеру 30 праймеров будут вести себя в одной пробе. У Гордиза получается конечно. И то рекомендует понижение скорости в протоколе.
[/quote]
Да ради бога, не жалко, пользуйтесь, сейчас все доступно! https://strbase.nist.gov//cattleSTRs.htm
Это правда, что некоторые праймеры нужно корректировать - у каждого своя кухня.
И все краски к ним могем сделать, также как и сайз стандарты и все прочее... Аллельный ладдер для крс, свиней, кошек, собак и крокодилов это слишком жирно. Хоть 25 пар праймеров в одной пробирке! Но никакого желания, так как все перепробовал, удовлетворился...вообщем не боги горшки обжигают.
А советы - пожалуйста.

СФ, нонадропы - это дорого. В последние годы все Qubit покупали, но и он сейчас смотрю подорожал https://alamed.ru/catalog/genomika/probopodgotovka/35536/
https://www.thermofisher.com/ru/ru/home/ind...ters/qubit.html

Чем длиннее, тем интенсивнее светятся? Глубоко ошибаешься, маэстро!
Чем короче ампликон, тем эффективнее реакция, и даже на вдрыск порванной ДНК (РНК), так что не надо ля-ля. Иногда на порядки чувствительность выше!

В STR идентификации конечно нужно знать сколько добавлять ДНК в реакционную пробирку (достаточно 1-10 нг для рутинных работ). Когда-то я выбирал эти самые STR праймеры для лошадей и КРС.
Значит, кроме реал-тайм ПЦР у Вас есть и капиллярник тоже, то бишь секвенатор?
Мой совет, пользуйтесь испытанным китом для выделения ДНК, который "не теряет ДНК" в процессе, они есть в продаже (не буду заниматься рекламой). Иногда можно и не выделять ДНК, а делать "директ ПЦР". А Белгород прямо васюки 21 века.

Сомневаюсь что на это надо тратиться, тем более на рынке их такое разнообразие. Ты лучше свои магнитные шарики доводи до совершенства.
А на сегодняшний день актуально "direct RT-PCR", т.е. без всяких выделений образец попадает прямо в реакционную смесь. Лучшие умы сейчас над этим работают!
А штативы не твоё, Генсек, бросай это дело, направь свой гениальный разум на великие цели!

Ну тоже ничего... Но лучше на митохондриалку, а еще лучше на высококопийные повторы, которых несколько тысяч на геном. Вот тогда чувствительность будет на самом высоком уровне.

Ооогоо, какая инфа всплыла в поисках контактов чела!
Ну вроде давно обсуждали, что молбиол КТО-ТО КОМУ-ТО продал, типа хозяин сменился. Нет?

Сейчас мода на ТЕ с высоким рН Отстаем, старый стал...

Делали в Туле, названия как такового не было. Там действительно 4 шт. пельтье, которые были посажены на "специальный компаунд", как говорили ребята-умельцы из Тулы. Впоследствии заменили на 1 большой и надежность прибора возросла резко.
У меня до сих пор в голове это жужжание, днем и ночью молотили...

Теория канешна рулит, но практика показала таки лучше (удобнее) 5-10 мкм, чем наноразмеры. И для работы вручную, и на роботах... для выделения ДНК и РНК имею ввиду.
А чайник явно загнул с потребностью для опытов. Что с них, бизнесменов, возьмешь.

Все правильно! Условия должны быть приближены к экстремальным.
Если пользователь говорит, что "это же удобно!!!" стоит прислушаться, черт побери!
Проблема в другом - не до конца насушили, источник контаминации остался в жидком виде.

С другой стороны, если не будет по стране массово "обнаруживаться" такое количество позитивных образцов, то мы пожалуй можем упустить лидерство по всем показателям пандемии. Скоро полмиллиона инфицированных, а умерших - пшик.

Вы слишком... хорошего мнения о разработчиках ПЦР китов. siRNA
Нынче разработчики в свои инструкции ввели такой раздел - "Интерферирующие вещества" (думаю слямзили с какой-нибудь англояз. версии ВОЗ рекомендации, не утруждаясь в переводе на русский).
Речь идет об ингибировании ОТ-ПЦР, вернее, какие сопутствующие вещества могут ингибировать реакцию (кровь, гной, слизь ит.п.) и как важно выделение чистой РНК.
Но о последствиях кросс-контаминации при этом мало кого волнует.

Монах, хороший совет! Я бы даже 20 к 1 сделал.

Выключать нельзя - там циркуляция через каждые 3-6 часов срабатывает по программе.

Если полгода простоит какой смысл тогда покупать установку?
Лучше саму воду покупать, ятак думаю.
Я равномерно сливаю неиспользованную лишнюю воду в раковину, а когда начинает мигать раньше времени - значит был сбой в э. сети. Пишите дату смены на картридже и спите спокойно.