Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Заморозка клеток -- Проблемы с заморозкой клеток --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Artin




 прочитанное сообщение 21.09.2018 12:47     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Приветствую уважаемых форумчан!

Возникла проблема следующего толка. В лабе полетела холодильная установка, дающая возможность хранить клетки и прочий биоматериал при -80 градусах по Цельсию. Чтобы спасти клетки (стабильные клеточные линии, используются для культивации, заморожены в DMEM-e с 10 % содержанием DMSO и 10 % FBS) пришлось перевозить их в дьюаре с жидким азотом в другую холодильную установку и оставлять уже в ней культуры на хранение при - 80 градусах Цельсия. Соответственно, теперь для культивации данных линий приходится опять использовать дьюар с азотом, везти их в свою лабу и там уже проводить разморозку вплоть до оттаивания (сразу скажу, что покультивировать клетки там где они хранятся и везти охлажденные суспензии "разогнанных клеток" я не могу). Разморозку я провожу след образом: кладу криопробирки с клетками в морозилку -20 на пол-минутки или минутку, чтобы немножко подогреть, а уже затем в водяную баню, вплоть до оттаивания; далее стандартное разбавление суспензии полной инкубационной средой, отмывка от DMSO и посев. Результат "обрадовал" уже на этом этапе: выживает процентов 10 от силы, также иногда происходит утрата типичной морфологии, в общем, пришлось изрядно проредить свою коллекцию. Видимо перепады температур с -80 до -195 и обратно клеткам явной пользы не несут.

Но все бы ничего, нашлись виалки с хорошо сохранившимися образцами, разогнал я их значится, провел 5-7 пассажей, нарастил новую массу и обратно в заморозку. Как вы уже поняли, канонично подморозить суспензии до -80 и в азот не было возможности. Так что часть клеток я подморозил на -20 и в азот, а часть кинул сразу в азот после добавления DMSO. Потом отвез соответственно в другую лабу, кинул в морозилку на -80 и планировал через пару месяцев опять их покультивировать. Пару месяцев прошло, привез клетки в свою лабу (снова алгоритм описывать не буду, думаю вы уже и так поняли smile.gif ), а там стабильная дохлятина выходит.

Такие вот дела. Может надо как-то оптимизировать данный процесс или такая пардон "дрочка" не несет в себе никакого смысла? Какие есть идеи по данному поводу.

Пы.сы: после того как бросаю виалки с криосредой (DMEM с 10 % содержанием DMSO и 10 % FBS) в жидкий азот (не важно подмороживал я ее на -20 или нет) -- по замороженной среде идут видные невооруженным глазом трещины.
Участник оффлайн! Vadim Sharov
Постоянный участник
Россия



 прочитанное сообщение 21.09.2018 13:18     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Замораживание клеток
http://molbiol.ru/protocol/19_01.html#a2

клетки необходимо замораживать медленно - понижение температуры со скоростью ~10С в минуту (варианты в зависимости от богатства: (i) программируемый холодильник; (ii) специальный контейнер (от Gibco или Stratagene); (iii) пенопластовая коробка с толщиной стенок ~1см. Контейнер или коробка помещаются в морозильник на -700С - -900С ON);


на -20 замороженные клетки храняться

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Artin
Участник оффлайн! Vadim Sharov
Постоянный участник
Россия



 прочитанное сообщение 21.09.2018 13:31     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Существует мнение, что клетки лучше замораживать без антибиотиков и не в ростовой среде, а прямо в сыворотке: 85-90% сыворотка и 15-10% DMSO. Причём эти авторы рекомендуют добавлять DMSO к охлаждённой до 0оС клеточной суспензии.

В некоторых лабораториях клетки замораживают не медленно, а быстро: в жидком азоте. И всё нормально. Однако в этом случае, хорошо бы подержать клетки при 4-0оС хотя бы 15', чтобы дать криоконсерванту время проникнуть в клетки.
Глицерол, DMSO и медленное охлаждение предотвращают образование кристаллов льда, которые губят клетки.

http://molbiol.ru/protocol/19_01.html#a2

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Artin
Участник оффлайн! Vadim Sharov
Постоянный участник
Россия



 прочитанное сообщение 21.09.2018 13:34     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Лучше чем замораживание в сыворотке (90%) DMSO (10%) не знаю. С фибробластами, даже первичными после такого замораживания не надо мучаться с откруткой от криопротектора. Развели средой, поместили в матрас, на следующий день сменили среду. А вот многие суспензионные надо откручивать, они от DMSO уходят в апоптоз.
Хранение на -20 сомнительно. В кельвинаторе должны года 2 храниться.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Artin
Участник оффлайн! petr
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 21.09.2018 17:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Ну и какой нехороший человек научил Вас так морозить клетки? weep.gif

У Вас проблема не на стадии разморозки. Я удивляюсь, что у Вас вообще что-то выживает. Клетки НЕ НУЖНО бросать в азот или просто кидать на -80.

В следующий раз морозите следующим образом:
1. Ресуспендируете осадок в 10% DMSO в FBS
2. Кладете vial в коробочку из пенопласта или что-то термоизолирующее (мы используем кусок пенопластового рэка от пробирок на 15мл, вставленного в пенопластовую коробку с крышкой).
3. убираете коробку на -80.
4. через 2-3 дня можно перенести в азот (в принципе клетки хранятся на -80 до полугода).

Разморозка - 5 мин в теплой бане, открцчиваете vial, отбираете супер, ресуспендируете осадок в среде и переносите туда, в чем растите клетки.

Удачи!

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Artin
Участник оффлайн! Artin




 прочитанное сообщение 21.09.2018 18:16     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Спасибо за ответы.

НО моя проблема не в том что я неправильно морожу клетки на -80. А в том что я НЕ МОГУ их правильно заморозить, т.к. сломался морозильник. Единственное что я могу себе позволить -- это подморозить их на -20 и кинуть в азот или просто кинуть азот. А также в том, что я вынужден устраивать перепады температур клеткам с -80 на -195 и обратно.

Так вот есть ли вообще в этом всем смысл? Или можно просто клетки формалинчиком залить, дабы не растягивать закономерный итог -- полную гибель клеток smile.gif
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 21.09.2018 19:04     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

Ну делайте ступенчатую заморозку (жидкий азот+спирт), морозьте до жидкого азота, там и храните. Чего их тягать туда-сюда?

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Artin
Участник оффлайн! Artin




 прочитанное сообщение 21.09.2018 19:10     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

(Vadim Sharov @ 21.09.2018 14:31)


Вот с быстрой заморозкой -- это пожалуй то, что я могу сделать в нынешних реалиях. А вот фишка с держанием клеток 15 мин при -4 -- это теория или опыт? Просто у меня шансов на ошибки много не осталось, хотелось бы уточнить smile.gif А то за 15 минут 10 % DMSO в теории может наделать делов, хотя минусовая температура....

А вот то что я ПОСЛЕ азота переношу их на -80 -- это нормально или не очень? Может лучше запастись азотом и хранить только там.
Участник оффлайн! Artin




 прочитанное сообщение 21.09.2018 19:14     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

(vb @ 21.09.2018 20:04)
Ссылка на исходное сообщение  Ну делайте ступенчатую заморозку (жидкий азот+спирт), морозьте до жидкого азота, там и храните. Чего их тягать туда-сюда?


А можно подробней про ступенчатую заморозку? И что там делает спирт? Не опытен я в юзании спирта smile.gif
guest: petr
IP-штамп: frESYufl5slOA
гость



 прочитанное сообщение 22.09.2018 05:01     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

А к сухому льду у Вас доступ есть?
Участник оффлайн! CowDoc
Постоянный участник
Middle East



 прочитанное сообщение 22.09.2018 11:01     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

Как выше уже отметили, у вас возможно проблема на стадии заморозки.
Лабороторные объемы клеток не морозим, и в основном суспензионные или первичку, но обычно основной ключивой момент:
- % DMSO - оптимальный для ваших клеток 5-20% (в замораживающей среде), конечный 2.5-10 в суспензии, подбираете опытным путем;
- вся процедура заморозки на холоде, постоянно перемешивая, замораживающая среда ХОЛОДНАЯ;
- добавлять ЗС очень медленно при постоянном перемешивании;
- ну и заморозка, в лабе пенопласт.коробка или фризмене на -20, через сутки на -80, после в LN2; или в программаторе.
Но это я про большие объемы заморозки, десятками литров!

Ну и разумеется, через пару суток, один флакон достаем и проверяем на стерильность, % D/L, и пр

Сообщение было отредактировано CowDoc - 22.09.2018 11:02
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 22.09.2018 18:37     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

(Artin @ 21.09.2018 17:14)
Ссылка на исходное сообщение  А можно подробней про ступенчатую заморозку? И что там делает спирт? Не опытен я в юзании спирта smile.gif

Какие у вас клетки?
Ступенчатая - типа к в программируемом замораживателе, только вручную, поэтому ступеньки температуры погрубее.
спирт - жидкая среда теплоноситель. В пенопластовой или эва посудине.
поищу методику попозже.
Участник оффлайн! CowDoc
Постоянный участник
Middle East



 прочитанное сообщение 23.09.2018 10:36     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

Судя по контексту, заморозка у вас спорадическая и не критическая ступень.
Зачем вам заморочка со ступенчатой, или программаторами?
Правильно вам советуют:
- вся процедура с холодными растворами, на льду, по капельке;
- в пенопластовую коробку с ячейками для крио, из морозилки!!! холодная должна быть;
- от объема на 2-5 часов (нужно провалидировать) на -20, потом сразу на -70 на ночь, после в азот, и все. Хотя у вас нет азота. Да, из моего промышленного опыта заморозки объемов клеток, перенос с -70 в азот, клеткам не вредит (первичка, ВНК, VERO, MDCK).
А то ведь можно дойти и до красивых игрушек ))) а-ля:
Thermo Scientific™ Mr. Frosty™ Freezing Container
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5100-0001
или Recovery™ Cell Culture Freezing Medium
https://www.thermofisher.com/us/en/home/lif...0180923072916:s
если бюджет проекта без мозгов, а время деньги
Участник оффлайн! Vadim Sharov
Постоянный участник
Россия



 прочитанное сообщение 23.09.2018 15:47     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

(Artin @ 21.09.2018 17:10)
Ссылка на исходное сообщение  Вот с быстрой заморозкой -- это пожалуй то, что я могу сделать в нынешних реалиях. А вот фишка с держанием клеток 15 мин при -4 -- это теория или опыт? Просто у меня шансов на ошибки много не осталось, хотелось бы уточнить smile.gif А то за 15 минут 10 % DMSO в теории может наделать делов, хотя минусовая температура....

А вот то что я ПОСЛЕ азота переношу их на -80 -- это нормально или не очень? Может лучше запастись азотом и хранить только там.



По ссылке и у меня в цитате обычные 4, +4 Стандартная положительная температура при которой максимальная плотность воды.

Я Вам представил стандартные проверенные процедуры. Раздел был создан в далекие времена, до разделения молбиола и во времена когда он был зарегистрирован как Средство массовой информации РФ.
Технологически мало, что изменилось, разве что на смену парам жидкого азота пришли низкотемпературные холодильники на - 130.

Замечу, что 15 минут прописано про некоторые лаборатории. В большинстве других тогда не заморачивались.
Кстати, если мне память не изменяет, еще лет 25 назад использование глицирина (многоатомного спирта) в качестве криопротектора считалось архаикой. Поэтому глицирин в качестве криопротектора уже не рассматривался на заре молбиола. Хотя, в коллекции ЦИНа в СПб еще хранились "глицириновые" ампулы.

Гланое медленное замораживание с криопротектором, 1 градус в минуту (важен порядок, а не точность до секунды). Это обеспечивается или коммерческим спецконтейнером или обычной, остающейся от рективов, закрывающейся пенопластовой коробочкой с толщиной стенок около 1 см. Тут тоже люфт допустим. Промежуточный этап на -20 возможен. Иногда удобен технологически. Разницы провезти через - 20 или сразу на -70 нет. Проверено.

на - 70 (тут минус) хранить можно. Стабильно около 2 лет. более глубокая заморозка предпочтительней. Долгое хранение на - 20 (минус) не желательно. Кому то везет , но печальный опыт, годный только для журнала отрицательных результатов, гласит :через полгода у Вас на -20 половина дохляка будет.

Еще раз правило: медленная заморозка до минус 70, быстрая разморозка.
Когда Вы переносите из азота на - 70, Вы медленно размораживаете клетки. Вы можете потратить время и посмотреть, прав ли я. Но я не стал бы проверять методики молбиола. Есть работающая методика? Не меняй!!!

Повторюсь на данном сайте в разделе "методы" http://molbiol.ru/protocol/ опубликованы отработанные методики.
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  19.11.2021 15:15     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

https://app.ex.co/stories/bestreplicawatche...-regime-for-you
https://rolexrelicawatches.hpage.com/replica-watches-uk.html
https://www.cgmimm.com/articles/hints-to-he...lica-watches-uk
https://www.deviantart.com/fakerolexwatches...es-UK-871090193
https://replicawatches24.exposure.co/best-r...eplicawatches24
https://knowyourmeme.com/users/replicawatchesuk
https://www.scoop.it/topic/bestreplicawatch...ica-rolex-watch
https://uberant.com/article/1268140-hints-o...ca-rolex-watch/
https://devpost.com/watcheshutuk
https://www.ted.com/profiles/26540630/about
https://drive.google.com/file/d/1uTx90WraSJ...iew?usp=sharing
https://ibb.co/hgfZwb0
https://writer.zohopublic.com/writer/publis...10192bd4c742ceb
https://replicawatches24.mystrikingly.com/b...ica-rolex-watch
https://my.desktopnexus.com/ReplicawatchesU...a-rolex--31049/
https://sway.office.com/Tqm7mC7s0VWLhKAl
Участник оффлайн! watchesonline89
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  26.12.2022 10:29     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

https://blog.udn.com/omegawatches89/176264446
https://teletype.in/@omegawatches89/CDyEM0Nch4X
https://wakelet.com/wake/7vB7d1grH5yswj4a12XAi
https://www.tripadvisor.it/Profile/352omegaw
https://homeinspectionforum.net/user/profile/72707.page
https://slidebatch.com/content/item/1353
https://omegawatches89.seesaa.net/article/490300679.html
https://slidebatch.com/profile/reactions
https://www.friday-ad.co.uk/profile/watches-s-co6llqqCqg==/
https://www.craftsforum.co.uk/forum/your-cr.../1130892-moulds
https://ameblo.jp/omegawatches89/entry-12756687889.html
https://telegra.ph/Reasons-Why-Replica-Watc...o-Popular-08-03
https://teletype.in/@omegawatches89/gUADjwow_lO
https://omega-watches-2.jimdosite.com/
https://plaza.rakuten.co.jp/omegawatches89/...y/202208040001/
https://list.ly/i/8020064
https://www.pearltrees.com/omegawatches89/item456651158

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 28.03.24 12:58
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft