Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
campus Участник Иркутск |
(vb @ 16.01.2012 01:14) жесть. ну люди то ладно, они живучие, а пластик и железо такого не переносят. обычно такой способ применяется для тотал дезинфекции инфекционных боксов после инфицированных 1-2 группой. потом меняют весь инвентарь, включая электропроводку. Именно с 1-2 группой и работаем, а также 3-ей и 4-ой. И ничего не меняли после дезинфекции, все фунциклирует. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(campus @ 17.01.2012 04:23) Именно с 1-2 группой и работаем, а также 3-ей и 4-ой. И ничего не меняли после дезинфекции, все фунциклирует. Но от контаминации не избавились, конечно . Но только честно? |
campus Участник Иркутск |
|
guest: ммм IP-штамп: frQlBxj4iQSg. гость |
Ну, вот опять формалин путают то с фенолом, то формамидом. ЭЭЭХ! |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(campus @ 18.01.2012 06:36) Избавились на пару месяцев, а потом опять полезло Не совсем понятно, это новая контаминация тем же самым была или первая очухалась после формамида Формалин, он же конц. формальдегид, очень сильно отличается от формаМИДА и, тем более, от фенола... Что было то? Подозреваю все-таки был формалин. Пары формалина способны модифицировать ДНК так, что некоторым полимеразам она становится недоступной матрицей. Но не всем полимеразам и не на 100% недоступной. Контаминация очухалась с ТЕМИ же праймерами? |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(guest: ммм @ 18.01.2012 10:18) Хорошо, что не с пиридином - это еще та вонючка, чемпион среди вонючен. От одного названия тошнит. |
campus Участник Иркутск |
to Ъ: Контаминация очухалась с ТЕМИ же праймерами? - ага, с теми же родоспецифичными праймерами. Хорошо, что не с пиридином - это еще та вонючка, чемпион среди вонючен. -а есть чудесная субстанция, меркаптоэтанол называется. Одного мкл достаточно для вони по всей лабе. |
CowDoc Постоянный участник Middle East |
(campus @ 16.01.2012 05:17) есть один жуткий и вонючий способ))) открытую банку с формалином на горелку, пущай выкипает 30-60 мин. Правда вонять потом несколько недель будет, хоть запроветривайся. Теоретически должен убивать ФСЕ жесть. ну люди то ладно, они живучие, а пластик и железо такого не переносят. обычно такой способ применяется для тотал дезинфекции инфекционных боксов после инфицированных 1-2 группой. потом меняют весь инвентарь, включая электропроводку. Именно с 1-2 группой и работаем, а также 3-ей и 4-ой. И ничего не меняли после дезинфекции, все фунциклирует. люди, "специалисты", вы чё? вас кто учил? вы, что не знаете, что в каждой ПРОИЗВОДСТВЕННОЙ лаборатории, научной, работающей с любыми патогенными микроорганизмами ДОЛЖЕН быть график проведения дезинфекций, и он должен соблюдаться, почитайте Guide to inspections of validation of cleaning processes и пр. правила. Весь мир, до сих пор, и Европа, и Штаты, и пр., не смотря на все визги охран труда, пользуются формалином, ну кто побогаче, газообразным Н2О2, есть еще море альтернатив, но эти лучшие! И ничего с проводкой даже за десятки лет не происходит, если помещение правильно построено. И даже, если там действительно!!! работают с 1 и 2ой группами (а не как здесь сказки рассказывают и дезинфекцию раз в 3 мес. проводят). Или они до сих пор лампочками синенькими светят, и считают это эффективной обработкой помещений? Просто, надо проводить дезинфекцию планово и после каждого рабочего процесса, в конце раб. дня (или если можно реже - каждую пятницу)))). А если у вас нет денег на газ-Н2О2 систему, то фарм. нейтрализуйте аммиачком (есть простые системы для этого, или по бедности, как делал я в детстве, два таймера, две независимые через таймеры электроконфорки, на одной фармол, на др. аммиак). ссылочка на вскид |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(CowDoc @ 18.01.2012 11:51) люди, "специалисты", вы чё? вас кто учил? вы, что не знаете, что в каждой ПРОИЗВОДСТВЕННОЙ лаборатории, научной, работающей с любыми патогенными микроорганизмами ДОЛЖЕН быть график проведения дезинфекций, и он должен соблюдаться, почитайте Guide to inspections of validation of cleaning processes и пр. правила. Весь мир, до сих пор, и Европа, и Штаты, и пр., не смотря на все визги охран труда, пользуются формалином, ну кто побогаче, газообразным Н2О2, есть еще море альтернатив, но эти лучшие! И ничего с проводкой даже за десятки лет не происходит, если помещение правильно построено. И даже, если там действительно!!! работают с 1 и 2ой группами (а не как здесь сказки рассказывают и дезинфекцию раз в 3 мес. проводят). Или они до сих пор лампочками синенькими светят, и считают это эффективной обработкой помещений? Просто, надо проводить дезинфекцию планово и после каждого рабочего процесса, в конце раб. дня (или если можно реже - каждую пятницу)))). А если у вас нет денег на газ-Н2О2 систему, то фарм. нейтрализуйте аммиачком (есть простые системы для этого, или по бедности, как делал я в детстве, два таймера, две независимые через таймеры электроконфорки, на одной фармол, на др. аммиак). ссылочка на вскид Доктор, речь не о дезинфекции и борьбе с патогенными микроорганизмами! Речь идет о нейтрализации ДНК-матрицы в ПЦР, т.е. о контаминации в ПЦР! Ее по другому называют "carry-over contamination in PCR" и борются с ней во всем мире, в том числе и в омериге, по-другому - комплекс мер, но больше профилавтических (пожар легче предотвратить, чем тушить ). Конечно, насыщенные пары формалина и перекиси могут модифицировать чистую ДНК..., но я представил Реал Тайм Термоциклер и NGS-секвенатор в дыму формалина или озона... |
CowDoc Постоянный участник Middle East |
ибо до сих пор, любимое развлечение (правда это уже мои сотрудники делают), разливаешь из одной пробирки по 10 (положительные и отрицательные пробы) и отдаешь ПЦР-щикам. Оооочень интересные результаты получаются, особенно, у многостаночников, которые зарабатывают от поставленных исследований. Так сказать, внутренний валидационный тест ))) Как потом завы этих лаб визжат (был случай лет 10 взад), когда им показываешь, что не все гладко в датском королевстве ))) |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(campus @ 18.01.2012 11:36) to ммм: Виноват, ошибся с названием во втором посте! Конечно, это был формалин. to Ъ: Контаминация очухалась с ТЕМИ же праймерами? - ага, с теми же родоспецифичными праймерами. Хорошо, что не с пиридином - это еще та вонючка, чемпион среди вонючен. -а есть чудесная субстанция, меркаптоэтанол называется. Одного мкл достаточно для вони по всей лабе. Два совета: 1. Если это возможно, меняйте (модифицируйте) праймеры. Достаточно поменять один. Как правило, новые праймеры всегда лучше старых (мы сами становимся умнее ), 2. Регулярно меняйте ПИПЕТКУ на пробоподготовке. Имеется ввиду именно ту пипетку, которой добавляете выделенную ДНК-матрицу к ПЦР мастермиксу. Научитесь делать плавные движения большим пальцем , когда пипетируете... Бороться с ампликонами нынче не модно - век Реал Тайм ПЦР. пыс: ну да, я о МЭ ничего не знаю - цветочки! |
campus Участник Иркутск |
1. Если это возможно, меняйте (модифицируйте) праймеры. Достаточно поменять один. Как правило, новые праймеры всегда лучше старых (мы сами становимся умнее wink.gif ), А какая разница, какие праймеры, если засер ДНК? 2. Регулярно меняйте ПИПЕТКУ на пробоподготовке. Имеется ввиду именно ту пипетку, которой добавляете выделенную ДНК-матрицу к ПЦР мастермиксу. Научитесь делать плавные движения большим пальцем smile.gif , когда пипетируете... Бороться с ампликонами нынче не модно - век Реал Тайм ПЦР. Есть некоторые скубенты, которых учить "делать плавные движения", все равно что Откуда все-таки уверенность про ампликоны, Ъ? "Доктор, речь не о дезинфекции и борьбе с патогенными микроорганизмами!" Абсолютно верно, я про работу в БМЗ слова не написал. |
DK. Постоянный участник |
(campus @ 19.01.2012 03:32) А какая разница, какие праймеры, если засер ДНК? - ампликонами... ну может занести , но чтобы ДНК! - это же как исхитриться надо!
|
campus Участник Иркутск |
(DK. @ 19.01.2012 11:33) Если очень хочешь, своего добьешься! А если серьезно, то праймеры на разные гены одного и того же организма срабатывали одинаково - все пробы положительные, включая отрицательный контроль. Поэтому и предположение о ДНК, хотя это тоже спорно, может человек очень качественно умеет контаминировать ампликонами, хз. Сначала скубент работал с одной парой праймеров на ген А, пошел засер, все обработали, через пару недель продолжил работать, через 1,5-2 месяца опять засер. Меняли реактивы, праймеры и их стоки - без разницы. Взяли другую пару праймеров на ген В, пара недель все хорошо, потом опять засер. Опять меняли все что можно, включая пипетки, ситуация такая же. Все отмыли, скубента в отдельный ламинар, там через какое-то время опять засер. Скубент уже пару месяцев ручками не работает и все чисто. Посмотрим, что буде дальше. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(DK. @ 19.01.2012 22:33) Когда в день от 100 до 1000 ДНК в день, и "хитрить" не надо. Как Кампус говорит - засрёте пипетку как нечего делать. |
RJ Dio Постоянный участник |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
1. если контаминация ампликонами - меняем праймер(ы) и больше ничего не придумаешь и дешевле всего... Чтобы исключить контаминацию ампликонами, нужно следить за перемещением пипеток в помещениях. Желательно завести отдельную пипетку под КАЖДЫЙ используемый раствор (из кита или собственные растворы), а пипетку для фореза привязать металлической цепочкой к столу с форезной камерой. Все меры с антиаэрозольными фильтрами и UNG ферментом 100% гарантии не дают - развод на деньги... 2. Если настигла Вас контаминация ДНК-матрицей, то бишь кросс-контаминация исследуемой ДНК - меняем пипетку, "моем формалином". Чтобы предотвратить кросс-контаминацию используем пипетку с "позитивным вытесненем" или пипетку без сбрасывателя, т.е. носик снимает левой рукой (если правша) и только после этого плавно отжимаем тот самый Большой палец. . Нервных скубентов - на исправительные (подходящие) работы. |
campus Участник Иркутск |
(-Ъ- @ 20.01.2012 02:24) campus, 1. если контаминация ампликонами - меняем праймер(ы) и больше ничего не придумаешь и дешевле всего... Чтобы исключить контаминацию ампликонами, нужно следить за перемещением пипеток в помещениях. Желательно завести отдельную пипетку под КАЖДЫЙ используемый раствор (из кита или собственные растворы), а пипетку для фореза привязать металлической цепочкой к столу с форезной камерой. Все меры с антиаэрозольными фильтрами и UNG ферментом 100% гарантии не дают - развод на деньги... 2. Если настигла Вас контаминация ДНК-матрицей, то бишь кросс-контаминация исследуемой ДНК - меняем пипетку, "моем формалином". Чтобы предотвратить кросс-контаминацию используем пипетку с "позитивным вытесненем" или пипетку без сбрасывателя, т.е. носик снимает левой рукой (если правша) и только после этого плавно отжимаем тот самый Большой палец. . Нервных скубентов - на исправительные (подходящие) работы. Во многом согласен с Вами, но "завести пипетку под каждый используемый раствор" не имеем физической возможности. Я только недавно добился (!), чтобы у каждого был свой набор пипеток, но в случае со скубентом это не помогло. А форезная у нас не то что в соседнем блоке, а на другом этаже и, есессвенно, с отдельным набором пипеток. А вот насчет рукой снимать носик, так это вообще пипец будет, устряпает всё! |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(campus @ 20.01.2012 14:06) Во многом согласен с Вами, но "завести пипетку под каждый используемый раствор" не имеем физической возможности. Я только недавно добился (!), чтобы у каждого был свой набор пипеток, но в случае со скубентом это не помогло. А форезная у нас не то что в соседнем блоке, а на другом этаже и, есессвенно, с отдельным набором пипеток. А вот насчет рукой снимать носик, так это вообще пипец будет, устряпает всё! У каждого свой набор - это само собой! А как же иначе. В крайнем случае для дорогостоящих компонентов (праймеров, нуклеотидов, "добавок", Магния и др.) должна быть одна, а для всякой ДНК, особенно плазмидной, - ДРУГИЕ. |
campus Участник Иркутск |
с тяпницей, Ъ |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(campus @ 20.01.2012 19:55) праймеры, нуклеотиды, магний, разве это дорогостоящие компоненты? Вот кабы для ревертазы, полимеразы, да под микс сиквенсовой, та да, для дорогостоящих с тяпницей, Ъ Действительно, я же совсем про ферменты-антитела забыл. В тяпницу вечером голова квадратная Спасибо! |
campus Участник Иркутск |
|
DK. Постоянный участник |
(-Ъ- @ 20.01.2012 11:24) campus, - вдобавок, эффективны только, если все в лаборатории перешли на UNG.1. если контаминация ампликонами - меняем праймер(ы) и больше ничего не придумаешь и дешевле всего... Чтобы исключить контаминацию ампликонами, нужно следить за перемещением пипеток в помещениях. Желательно завести отдельную пипетку под КАЖДЫЙ используемый раствор (из кита или собственные растворы), а пипетку для фореза привязать металлической цепочкой к столу с форезной камерой. Все меры с антиаэрозольными фильтрами и UNG ферментом 100% гарантии не дают - развод на деньги... А если, вдобавок ко всем прочим мерам, поместить всю пост-ПЦР ( по существу, только открывание проб и форез) под тягу - это не снизит вероятность контаминации? Мы у себя так и сделали - вроде, пока эта..., не к вечеру будь помянута, не настигла - но не исключено, что это "дутье на воду" . |
nkkrg |
Уже около года бьюсь с одной проблемой. Опишу все с самого начала, и с чего все началось. Я работаю с риккетсиозами, детектирую их при помощи ПЦР, а изначальный материал - это клещи, из которых готовлю суспензии (по стандартной методике, как обычно, не пулами), затем выделяю из суспензий ДНК, затем ПЦР, электрофорез, и, если повезет, чищу пробы и секвенирую. Начал работать с ними примерно с февраля прошлого года, примерно до мая все было хорошо, но потом началось что то странное. По видимому на каком то этапе произошла контаминация, сейчас уже не представляется возможным установить, где она была и что было загрязнено, но после этого на электрофореграммах стал светиться отрицательный контроль, сначала бледно, но потом все ярче и ярче. Сразу говорю, что ПЦР тест систем на риккетсии нет, по крайней мере я не слышал, положительного контроля соответственно тоже нет, поэтому приходится все подбирать вручную, концентрацию реагентов, условия под праймеры и т.д. Я пользуюсь определенными ПЦР наборами со стандартными наборами реагентов (буфер, магний, dntp и т.д.), поначалу работал с одной парой праймеров, конкретно на участок гена rOmpB, потом заказал на rOmpA, но вообще в самом начале ставил на 16S, и только потом отбирал положительные и прогонял по rOmpB, потом от этого отказался, т.к. стало не целесообразно. Конкретно про контаминацию: что только не перепробовал, ПЦР наборы неоднократно заменялись новыми, стоки праймеров и разведенный праймеры тоже, лаборатория и все боксы дважды обрабатывались формалином, все пипетки тоже, амплификатор также обрабатывался, ничего не помогло. Правда, какое то время после обработки формалином отриц. контроль перестал светиться, но потом опять все вернулось, как было. Пробовал даже ставить в другом боксе, который изолирован от тех, в которых я работал раньше и туда никак не могла залезть ДНК (или что это?), по началу не светилось, я даже просеквенировал несколько проб, но потом в итоге выяснилось, что нуклеотидные последовательности одного участка гена (rOmpB) у разных проб полностью идентичны, хотя я специально отбирал для этого материал с разных районов, расстояние между которыми очень огромное, это говорит о том, что пробы загрязнены. Вот буквально недавно отобрал абсолютно других клещей, сделал суспензии, выделил ДНК, поставил ПЦР, все равно светиться, обидно, уже почти год работаю в пустую, только трачу реактивы, а контаминация все еще есть. Я просто уже не знаю, где и на каком этапе она попадает в пробирки, т.к. работаю максимально аккуратно, даже когда только начинал, не так аккуратно работал, но такого не было никогда. Что можете посоветовать? |
RJ Dio Постоянный участник |
|
Guest IP-штамп: frBHAZip1zz5U гость |
По-видимому, пробы у Вас уже тоже "подзагажены" |
vtosha Постоянный участник |
Форезы светятся на уровне предположительно контаминирующего фрагмента или на других длинах тоже? Работаете в перчатках-халатах? Достаточно ли интенсивно меняются перчатки и стираются халаты? Сообщение было отредактировано vtosha - 14.03.2012 14:18 |
campus Участник Иркутск |
(Guest @ 14.03.2012 00:37) ПЦР-ТС на риккетсии есть =) пипеточки и наконечники у Вас все с фильтрами? По-видимому, пробы у Вас уже тоже "подзагажены" На какие риккетсии? Наборы какой фирмы? Ссылочку скиньте, плиз. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Guest @ 14.03.2012 11:37) ПЦР-ТС на риккетсии есть =) пипеточки и наконечники у Вас все с фильтрами? По-видимому, пробы у Вас уже тоже "подзагажены" Это точно... Я бы перешел на другие праймеры, с другой рамки. Если же Вы сами и секвенируете ампликоны напрямую, то это финиш... Ничего не поможет. Короче, ррезать нада... |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(vtosha @ 14.03.2012 15:17) Какой длины контаминирующая полоска? Форезы светятся на уровне предположительно контаминирующего фрагмента или на других длинах тоже? Работаете в перчатках-халатах? Достаточно ли интенсивно меняются перчатки и стираются халаты? В приличных домах халаты не стирают... Про интенсивность смены перчаток - прекрасный совет. Чем чаще, тем лучше. А я сам так и не привык к перчаткам и, вообще, не люблю эти резино-силиконовые изделия. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(campus @ 14.03.2012 15:53) На все, т.е. генеральную. У меня есть, популярный кит, кстати... |
nkkrg |
|
Nett Постоянный участник |
Значит так. Берётся по очереди каждый из реагентов Вашей самосборной "тест-системы", пцрится с другими, чистыми миксами в максимально удалённом месте (но опять же, если источником контаминации была пипетка, она уже во всё Вам успела "нафукать") Что-то я сомневаюсь, что при хронической контаминации Вам поможет простой переход на изогеновскую ТС, по крайней мере, пока источник не установили Реамплификацией не занимались? |
RJ Dio Постоянный участник |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Nett @ 15.03.2012 11:04) Голые реактивы и праймеры не светятся, но отрицательный контроль положителен? или всё же отрицателен? Значит так. Берётся по очереди каждый из реагентов Вашей самосборной "тест-системы", пцрится с другими, чистыми миксами в максимально удалённом месте (но опять же, если источником контаминации была пипетка, она уже во всё Вам успела "нафукать") Что-то я сомневаюсь, что при хронической контаминации Вам поможет простой переход на изогеновскую ТС, по крайней мере, пока источник не установили Реамплификацией не занимались? Они секвенированием занимались . |
campus Участник Иркутск |
(-Ъ- @ 14.03.2012 11:57) так что за кит все-таки? самосборный или коммерческий? |
Guest IP-штамп: frBHAZip1zz5U гость |
|
Малина Малиновна |
|
Малина Малиновна |
|
Малина Малиновна |
|
Bear Постоянный участник Москва |
(Малина Малиновна @ 18.10.2018 15:51) Подскажите какие существуют официальные нормативные документы либо др. по смывам в ПЦР- лаборатории, и все что может регламентировать порядок проведения смывов. Естественно при подозрении на контаминацию, и др. понятно. А вот есть что то прописано в рекомендациях, либо др. документах обязательных к исполнению, типа СанПин и прочее? Очень надо к понедельнику!!! Вы очень сумбурно пишите! Вот, например. есть ГОСТ: |
Carbon Copy Постоянный участник So close no matter how far |
|
Vadim Sharov Постоянный участник Россия |
ГАРАНТ.РУ: Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 11 января 2011 г. N 1 г. Москва "Об утверждении СП 3.1.5.2826-10 "Профилактика ВИЧ-инфекции" Национальный стандарт Российской Федерации. Технологии лабораторные клинические. Обеспечение качества клинических лабораторных исследований. Часть 2. Руководство по управлению качеством в клинико-диагностической лаборатории. Типовая модель Другой можно найти здесь |
Vadim Sharov Постоянный участник Россия |
(Малина Малиновна @ 18.10.2018 12:56) Курсы повышения квалификации: Если Вы хотите работать, а не кидать реплики на молбиоле, справка об окончании таких курсов обязательна. На курсах литературу дадут. |
Vadim Sharov Постоянный участник Россия |
(Малина Малиновна @ 18.10.2018 13:13) Еще вопрос: в инструкции предусмотрена выдача результатов ПЦР (доноры) - либо отр-, либо пол+. Если проба из трех постановок один раз пошла на поздних циклах (но все же +!), и два раза отрицательная - можно выдавать "сомнительная" и пусть разбирается инфекционист. Если бы не касалось донорской крови вопросов бы не было, Спасибо заранее!! Возможные причины: 1. Начало заражения малая вирусная нагрузка. 2. Контаминация в воздухе 3. "Руки не оттуда" снимается отсутствием сигнала на ранних циклах. Необходимо провести подтверждающий на Вестерн блоте, как при положительной пробе. Даже если он отрицательный, все равно проверка донора через полгода на ВИЧ. Если мы говорим о ВИЧ, а не о вирусе гепатита. Контаминация в одной пробе редкость, обычно идет косяком ложноположительное. И, главное, наши советы просто советы, инфекционист должен знать о положительной пробе. Несмотря на "поздние циклы". |
бутанол Постоянный участник Новосибирск |
Как версия. Ампликон в к- более эффективно сорбируется пластиком.. и поэтому реакция отрицательна, а в пробах соответственно- нет. |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |