molbiol.ru -> Кривые плавления

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Кривые плавления -- интерпретация HRM --

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

error
Постоянный участник
192.168.0.1

31.10.2008 08:13

URL #1

Ищу SNP. На прошлой неделе дорвался до HRM девайса - Idaho LightScanner.
Прогнал несколько плашек - теперь думаю, как интерпретировать полученные кривые плавления. Софт группирует образцы автоматически. В софте оном есть чудесная штука - Sensitivity - ее крутишь, количество и состав обнаруженных групп, понятно, меняется. На мой непосвященный взгляд, сие напоминает доводку рН буфера посредством верчения ручки "КРУТИЗНА" на рН-метре. Изначально идея была выбрать из каждой группы по паре образцов и секвенировать. Типа, затраты на сиквенс слегка оптимизировать в свете глобального финансового кризиса - 96 пар праймеров х 60 индивидуумов все же не сову об пень. Но как-то очень субъективно процесс выглядит... На приведенной картинке оно видит три группы, плюс зеленые кривые - образцы, которые софт затруднился отнести к какой-либо группе. Да, размер фрагментов 250-400 bp, химия GoTaq Hot Start + LC Green.

Any ideas, opinions?

Картинки:
картинки уже нет на сайте: Plate8_2.jpg

Plate8_2.jpg — (78.41к) 31.10.2008 — 14.11.2008

D evgenii
Постоянный участник
Томск

31.10.2008 08:51

URL #2

Работаю с HRM на Corbett Research.
Использую профили сравнения:
положительный (мутации);
норма (без мутации);
исследуемый образец.
От этого и пляшу...

Поблагодарили (1): error

error
Постоянный участник
192.168.0.1

31.10.2008 09:11

URL #3

Дык, в том-то и дело: чтобы профили идентифицировать, нужно сначала скрининг прогнать. Если я из зоопарка, что на картинке, отберу, скажем 8 образцов и отдам на растерзание злым дядькам из Агенкорта, можно ли полагать, что остальные 52 с данной точки зрения интереса не представляют?

D evgenii
Постоянный участник
Томск

31.10.2008 09:24

URL #4

Хмм....

Пока в голову приходит только выход, указанный вами. Для достоверности погонять несколько раз одни и те же пробы, удостоверится, что действительно различия присутствуют.
А что кстати за образец?

error
Постоянный участник
192.168.0.1

31.10.2008 09:34

URL #5

геномная ДНК, все банально. насчет несколько раз погонять была мысль... можно попробовать, если на пиве не разорюсь, ибо прибор не мой

D evgenii
Постоянный участник
Томск

31.10.2008 09:41

URL #6

"Если б море было пивом..."
- хорошая песенка

Если что-нить надумаю еще... напишу

Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость

31.10.2008 15:42

URL #7

Тяпничная раслабуха...

...губит людей не пиво,
губит людей вода.

Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость

31.10.2008 15:52

URL #8

Не будь на то Господня воля,
мы б не узнали алкоголя;
а, значит, пьянство не порок,
а высшей благости урок.

error
Постоянный участник
192.168.0.1

31.10.2008 16:27

URL #9

Кому тяпнецо, а у кого ПОНЕДЕЛЬНИК НАЧИНАЕТСЯ В СУББОТУ

Yuri K
IP-штамп: frbSxBL61s/9I
гость

31.10.2008 17:04

URL #10

I am lost here. Since all melting curves are of the same shape, only shifted along the T axis, the difference curves must also be of the same shape. Nevertheless, some show bell curves with a maximum and some show bell curves with a minimum, and some curves are S-shaped. Why would this be the case?

error
Постоянный участник
192.168.0.1

31.10.2008 17:35

URL #11

(Yuri K @ 31.10.2008 10:04)

Насколько я понял, софт считает отклонение от средней интенсивности флуоресценции в каждой точке кривой, поэтому график и называется Normalized difference curves. Для тех же кривых плавления можно построить первую производную, как обычно:

Картинки:
картинки уже нет на сайте: Plate8_2a.jpg

картинки уже нет на сайте: Plate8_2a.jpg

Plate8_2a.jpg — (49.06к) 31.10.2008 — 14.11.2008

Yuri K
IP-штамп: frbSxBL61s/9I
гость

31.10.2008 18:01

URL #12

(error @ 31.10.2008 16:35)

Right, but I still don't get it. What is "средней интенсивности флуоресценции ?"

error
Постоянный участник
192.168.0.1

31.10.2008 18:27

URL #13

average normalized fluorescence across the samples at the given t, may be?

Yuri K
IP-штамп: frbSxBL61s/9I
гость

31.10.2008 19:10

URL #14

Fuck knows what this means. Basically, the shitheads who wrote the soft are making the calls for you and I totally hate that.

Guest
IP-штамп: frnwErsgt6v.2
гость

05.11.2008 00:21

URL #15

Три уточняющих (возможно, наивных) вопроса:
1. На что нормализуете?
2. Как меняется состав и количество групп при увеличении/уменьшении "sensitivity"?
3. Поскольку LightScanner плашечный, в отличие от LightCycler 1.0-2.0, RG и HR-1, то надо еще исключить неравномерность прогрева/охлаждения. Не пробовали гонять один и тот же образец в разных лунках?

Guest
IP-штамп: frnwErsgt6v.2
гость

05.11.2008 00:23

URL #16

Да, кстати, хоть один WT-контроль и/или Mut-контроль имеется?

error
Постоянный участник
192.168.0.1

05.11.2008 01:23

URL #17

(Guest @ 04.11.2008 17:21)

Хм, я ХРМ вообще первый раз гоняю

1. Насколько понял, нормализация производится по флуоресценции самого образца при двух температурах: до и после плавления. Это позволяет отсечь неспецифику, если таковая присутствует (плавится при более низкой температуре).
2. При уменьшении чувствительности количество групп снижается, разбиение по группам меняется соответственно - софт разбрасывает те же образцы на меньшее число групп. Чем больше чувствительность, тем неувереннее становится calling - групп больше, и больше образцов, которые софт затрудняется отнести к какой-либо группе.
3. Нагрев/охлаждение в LightScanner осуществляются потоком воздуха, захват картинки CCD-камерой, как я понял. Неравномерность температуры при такой конструкции минимальна по сравнению с Пельтье-блоком. Критично - плашки черные, лунки белые. В разных лунках гонять несколько повторностей была мысль, но для моих целей наличие false positives не критично, так что не стал.

(Guest @ 04.11.2008 17:23)

Да, кстати, хоть один WT-контроль и/или Mut-контроль имеется?

Нет - это первичный скрининг. Только вскрытие (сиквенс) покажет

Хозяева прибора, впрочем, генотипирование на нем гоняют. Пока что работает.

Guest
IP-штамп: frE5ApBDd2PUQ
гость

07.11.2008 02:46

URL #18

1. Ну, это не совсем нормализация - хотя и очень полезная штука. Неравномерность она не компенсирует.
2. Я бы поступил вот как: выкрутил бы sensitivity на максимум, зафиксировал бы результаты, затем выкрутил бы ее на разумный минимум, также зафиксировал бы результаты, образцы, одинаково расклассифицированные в обоих случаях как принадлежащие к разным подгруппам, просеквенировал бы (2-4 образца на один снип), если результаты сиквенса совпадут с ожидаемыми, то поставил бы мелтинг всех остальных образцов с опорой на эти как на контрольные. Думаю, так Вы усилия на сиквенс потратите минимальные и из мелтинга извлечете максимум пользы.
3. Воздух-то воздухом, а неравномерность все равно имеется, про это у Виттвера две статьи есть, одна 2003, другая 2006, кажется, года.

Поблагодарили (1): error

error
Постоянный участник
192.168.0.1

07.11.2008 03:46

URL #19

Примерно так и сделал

Сиквенсы через неделю приедут, наверное...

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

07.11.2008 12:25

URL #20

(error @ 07.11.2008 02:46)

Примерно так и сделал

Сиквенсы через неделю приедут, наверное...

Похоже у тебя сиквенсы пишком ходют

Нормально - вечером отправил -утром получил

Чего ты к Лайтсканнеру привязался если три манускрипта

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

07.11.2008 12:51

URL #21

(error @ 05.11.2008 00:23)

Хм, я ХРМ вообще первый раз гоняю

1. Насколько понял, нормализация производится по флуоресценции самого образца при двух температурах: до и после плавления. Это позволяет отсечь неспецифику, если таковая присутствует (плавится при более низкой температуре).
2. При уменьшении чувствительности количество групп снижается, разбиение по группам меняется соответственно - софт разбрасывает те же образцы на меньшее число групп. Чем больше чувствительность, тем неувереннее становится цаллинг - групп больше, и больше образцов, которые софт затрудняется отнести к какой-либо группе.
3. Нагрев/охлаждение в ЛигхтСцаннер осуществляются потоком воздуха, захват картинки ЦЦД-камерой, как я понял. Неравномерность температуры при такой конструкции минимальна по сравнению с Пельтье-блоком. Критично - плашки черные, лунки белые. В разных лунках гонять несколько повторностей была мысль, но для моих целей наличие фалсе поситивес не критично, так что не стал.
Нет - это первичный скрининг. Только вскрытие (сиквенс) покажет

Хозяева прибора, впрочем, генотипирование на нем гоняют. Пока что работает.

А как же ХРМ на ЛайтЦиклер 480 который Пелтье ?

У Роша концы с концами того

http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n3/...meth.f.207.html

error
Постоянный участник
192.168.0.1

07.11.2008 15:38

URL #22

(Guest @ 07.11.2008 05:25)

Похоже у тебя сиквенсы пишком ходют

Нормально - вечером отправил -утром получил

Чего ты к Лайтсканнеру привязался если три манускрипта

Дык, если лайтсканнер с айплексом отработают как надо - четвертый в Природу

watchesbiz
Постоянный участник

03.01.2022 09:32

URL #23

https://wanelo.co/replicarolexwatches
https://musescore.com/fakerolexwatches
https://www.racked.com/users/Replicarolexwatches
https://sketchfab.com/Rolexrelicawatches
http://www.video-bookmark.com/bookmark/433...eplica-watches/
https://www.slideserve.com/ReplicawatchesUK...pt-presentation
https://www.theverge.com/users/Replicarolexwatches
https://www.yumpu.com/en/document/read/6532...lica-watches-uk
https://online.flippingbook.com/view/152275247/
https://www.instapaper.com/p/8767342
https://www.bigblueview.com/users/Replicarolexwatches
https://weheartit.com/watcheshutuk
https://sites.google.com/view/replicarolexwatches24/home
https://www.indiehackers.com/post/hints-on-...atch-113aef73a9
http://replicawatchesuk.esportsify.com/for...ica-rolex-watch

vadimchik152a
Постоянный участник

11.09.2022 21:26

URL #24

Теперь становится очевидно, что постоянный количественный рост и сфера нашей активности позволяет оценить значение правильных направлений развития. https://www.englishbaby.com/findfriends/gal.../detail/2411372

Ufa1688
Постоянный участник

19.09.2022 18:58

URL #25

But there were darker สล็อตออนไลน์ sides to British rule in Singapore UFA1688 too. Experts point out the colonial ลิงค์รับทรัพย์ administration suppressed แฮนดิแคป the local identity and aff 1688 made English the official language. ufabet เข้า สู่ระบบ They also say modern Singapore’s ทางเข้าufa1688 infamous tough stance บอลสเต็บ towards hard drugs was ราคาบอล a result of colonial Britain’s lucrative ufa1688 opium trade.

vadimchik152a
Постоянный участник

02.10.2022 19:28

URL #26

Равным образом постоянный количественный рост и сфера нашей активности требует от нас анализа системы массового участия. https://www.nvtesol.org/profile/aleksej79f/profile

Ufa1688
Постоянный участник

03.10.2022 19:29

URL #27

Seaman Recruit Ryan ufa1688 Mays was acquitted on ราคาบอล charges of willful hazarding สล็อตออนไลน์ of a vessel and aggravated UFA1688 arson, the Navy said in a statement ลิงค์รับทรัพย์ following a court martial แฮนดิแคป in which a judge ruled บอลสเต็บ there was not enough evidence ufabet เข้า สู่ระบบ that Mays set the fire that destroyed ufa1688auto the USS Bonhomme Richard ufa1688 auto ทางเข้า more than two years ago.

vadimchik152a
Постоянный участник

05.10.2022 01:21

URL #28

Теперь становится очевидно, что сложившаяся ситуация ни коим образом не позволяет выполнить важные задания по разработке новейших вариантов поиска решений. https://www.catholicmensministry.com/profil...vikgbur/profile

vadimchik152a
Постоянный участник

08.11.2022 01:41

URL #29

Таким образом реализация намеченных плановых заданий способствует подготовке и реализации системы массового участия. https://joyrulez.com/blogs/201479/%D0%A9%D0...%96%D0%B0%D0%BB

vadimchik152a
Постоянный участник

05.03.2023 13:32

URL #30

Does not follow, however, to forget that further development of different forms of activity assists preparation and realization and analysis of necessary data for permission of situation on the whole. https://www.moreflows.com/author/dima48i/

vadimchik152a
Постоянный участник

07.03.2023 15:39

URL #31

On the other hand a permanent quantitative height and sphere of our activity stipulate creation of directions of progressive development largely. http://www.babelcube.com/user/maksim-mihajlov

vadimchik152a
Постоянный участник

07.03.2023 15:44

URL #32

It is nevertheless needed to mark similarly, that the folded situation not which character does not require determination and clarification of new suggestions. http://uid.me/denis_alekseev544

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.