Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Загадка ПЦР?
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Fox
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.11.2004 03:23     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Коротко вводная: - амплифицируется микросателлитный локус из тотальной ДНК моллюска, т.е. за фланкирующие участки вытаскивается один (у гомо) или два (у гетерозигот) аллеля. Разница в длине между ними 3-15 нуклеотидов. Невелика.
Весь сэмплинг 2003 года работает как часы - все по HWE, интенсивность аллелей в гетерозиготах одинакова. Берем материал 2004 года, приезжаем в Швецию (т.е. меняем все реактивы, включая буфер полимеразы) и получаем.....
- в 40% случаев у гетерозигот одна аллель (ровно короткая или длинная) амплифицируется в несколько(до10) раз хуже другой!!!..... что делаем
1. повторяем - все повторяется у каждого моллюска
2. играем концентрацией ДНК на порядок туда-сюда НОЛЬ реакции
3. да праймеры тоже меняли - безрезультатно
4. уменьшаем температуру отжига и ... опаньки убогие аллели растут как на дрожжах...

опс скажите вы - так ведь они поди неспецифичные! и будете может правы, но я никогда не поверю, что за 1 год во ВСЕЙ популяции (миллионы, а выборки - тысячи) мутировали фланкирующие участки половины аллелей, на этом мои мысли заканчиваются smile.gif я полагаю что что-то в реакции

Ваше мнение?

возможно в субботу "дома" прогонят эти же образцы и что-то станец понятнее...
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.11.2004 10:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Возможное объяснение:
на участках посадки праймеров часто встречаются SNP. При пониженной температуре отжига они себя не проявляют. В буферных смесях, содержащих энхансер, тоже. Проявиться они могли из-за замены буфера или повышения температуры отжига. Более прозаичное объяснение - различия в калибровке температурных режимов термоциклеров.
Участник оффлайн! Kiskin
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.11.2004 11:11     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Скорее SNP в месте посадки праймера. Аналог видели у человека при анализе одного и того же STR в разных популяциях.
Участник оффлайн! Elena Voron
Участник
Новосибирск



 прочитанное сообщение 10.11.2004 11:28     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Явно следствие смены условий реакции (буфер, вода амплификатор). И не морочте себе голову всякими мутациями. Подбирайте заново условия и все. Сталкивались с такой проблемой пару раз из-за смены амплификатора и ... рук!
Участник оффлайн! Den
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.11.2004 14:27     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Скорее всего, виноват амплификатор, не всегда реакция отработанная на одном, хорошо идет на другом. Или буфер... Надо подбирать условия реакции заново.
Участник оффлайн! Kiskin
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.11.2004 14:49     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Да нет, бывает и на одном амплификаторе, и на одних реактивах, и в одних руках - но на ДНК из разных этносов.
Участник оффлайн! Fox
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.11.2004 15:56     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

1. Руки отменить smile.gif мои не очень поменялись за пару месяцев
2. На амплификатор тоже не хочется валить был ABI 2700 сейчас Eppendorf тоже не старый, не верю в принципиальные отличия между этими машинками
3. Популяция одна и та же! (не разные этносы smile.gif

4. Итак буфер - верю в SNP, тем более что локус заимстован у близкого вида. Сейчас используется Takara полимераза с буфером простым как пробка
10mM Tris-HCl(pH 8.3); 50mM KCl; 1,5mM MgCl2)
Раньше был Сибэнзим c буфером
60 mM Tris-HCl (pH 8.5); 25 mM KCl; 1.5 mM MgCl2;
10 mM 2-меркаптоэтанол; 0.1% Тритон X-100

Мне кажется что и тритон и меркаптоэтанол только стабилизируют фермент? Могут ли они приводить к менее специфичному связыванию с матрицей, т.е. к наблюдаемому ранее эффекту?
Участник оффлайн! le lapin
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.11.2004 16:21     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

Автор - Fox:

2. На амплификатор тоже не хочется валить был ABI 2700 сейчас Eppendorf тоже не старый, не верю в принципиальные отличия между этими машинками
 
Зря не веришь, Миша. У них наверняка разный ramping (скорость изменения температуры).
Кстати, если дело именно в этом, попробуй просто увеличить время отжига.
Участник оффлайн! VKV
Участник



 прочитанное сообщение 10.11.2004 18:52     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

Полимеразы у вас тоже различаются - это тоже важно. Сибэнзимовская - иногда лучше чем NEB, Promega ...
Участник оффлайн!




 прочитанное сообщение 10.11.2004 19:41     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

Что есть лучше?
Они просто разные. Полимеразы, амплификаторы, аллельные варианты... Эффективность синтеза разная... но есче несколько циклов и ... все реакции выйдут на насыщение. Если активности хватит конечно
Участник оффлайн! Fox
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.11.2004 19:59     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

так так так не отвлекаемся на полимеразы, я сам в свое время насравнивал разных, есть разные задачи свойства и т.п.

а как насчет Тритона и меркаптоэтанола?
Участник оффлайн! acher
Участник
Tomsk



 прочитанное сообщение 10.11.2004 20:03     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

уменьшаем температуру отжига и ... опаньки убогие аллели растут как на дрожжах...
Настораживает...однако. При уменьшении T отжига ... специфичность "обычно" падает... Возможно, в Швейцарии Вы "по-настоящему" амплифицируете, то, на что сделаны праймеры... Дома же -амплифицировали, то, на что вследствие конформации садились праймеры... frown.gif Не знаю, возможно ли пройтись по геному ваших "улиток" заново проверив подбор праймеров... вряд ли... Это худшее что может быть. Надеюсь, что (соглашусь с предыдущими участниками) виноват рэмпинг... Сравните его значение у ваших программ и амплификаторов вообще.
Участник оффлайн! Fedor K.

Москва



 прочитанное сообщение 11.11.2004 02:22     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

Это только на одном микросателлите так или на нескольких?
Участник оффлайн! AVS
Постоянный участник
UK - Russia



 прочитанное сообщение 11.11.2004 03:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

На разных полимеразах может быть всё, что угодно. Да и сиквенсом не мешало бы проверить, алель это вылезла или кака какая ...

Тритон и меркаптоэтанол - для лучшей растворимости. Первый ещё может белковые примеси денатурировать, а второй S-S связи рвёт у цистинов(при условии, что для фермента это не важно).
Участник оффлайн! Fox
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 11.11.2004 13:35     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

это на одном локусе, а вылезают точно аллели и точно сателлита - размер идеально подходит и слипаги (статер) есть. Буду пробовать увеличивать время отжига. Спасибо за советы.
Участник оффлайн! acher
Участник
Tomsk



 прочитанное сообщение 11.11.2004 13:45     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

Не совсем в тему, но все же... Так режет слух!
Аллель - он мой! Кофе - он мой! ... Мужики они в русском языке...
Участник оффлайн! Fox
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 11.11.2004 21:08     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

Так вот еще инфо. Похоже дело в рампинге smile.gif

ABI 2700 - 1c/sek
Eppendorf Mastercycler - 3c/sek

вот как - видимо сваливаются они, если так реактивно нагревать. Попробую уменьшить скорость - посмотрим что получится.
Участник оффлайн! Den
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 15.11.2004 18:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

acher, чувствуется Питерская школа smile.gif , в Москве аллель - женского рода.
Участник оффлайн! Fox
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 15.11.2004 20:30     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

Не скажите Den, мы вполне питерская школа, тем не менее аллель - она! Слишком уже женское имя - Аллель.

А в Москве - маркЕр!

К сабжу - уменьшение рампинга до 1гр/сек при нагреве после отжига реально помогает! Локус(ы) вообще прикольный - амплифицируется несколько локусов (семейство?) микросателлитов разных размеров. Все вариабельные. Надо заказать праймеры немеченные попробовать секвенировать - интересено smile.gif
Участник оффлайн! le lapin
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 16.11.2004 02:18     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

Денис, ты не прав! Посмотри в учебнике Вечтомова - там аллель женского рода. И школы тут не при чем. Аллель не менее женственна, чем параллель smile.gif
Участник оффлайн! Den
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 16.11.2004 12:05     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

Да, да! Спутал я.... Все наоборот. Аллель - он в Москве, она в Питере. А школы значение имеют, особенно в сфере родов и ударений smile.gif .
Да, относительно маркерОв и чипОв, тоже очень забавно.
Участник оффлайн! Den
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 16.11.2004 12:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

Fox, а ты не верил, что дело в амплификаторе smile.gif .
Участник оффлайн!




 прочитанное сообщение 16.11.2004 20:21     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #23 множественное цитирование

Den нашел брата! Старшего. Этот инструкции читает только если важный експеримент не выходит. И честно опосля докладывает. Чтоб публика более догадками не мучалась. Молодец!
Да... давненько я тут таких ярких молодых дарований не читал. Да в таких количествах!
Что забавно - все из Питера! Заповедник?
Участник оффлайн! Fox
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 21.11.2004 17:14     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #24 множественное цитирование

Злобный OFF

Спасибо dear <-гость-> за ценные советы высказанные Вами в ответ на мой, как Вы правильно заметили, элементарный вопрос. Надеюсь и в дальнейшем на Вашу поддержку и сочувствие. Разрешите в силу Вашей анонимности называть Вас Dr. R.Axel, или Dr. L.B.Buck (if you are lady).
Участник оффлайн! Aks
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 21.11.2004 18:39     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #25 множественное цитирование

Автор - <опять пришёл>:
Den нашел брата! Старшего. Этот инструкции читает только если важный експеримент не выходит. И честно опосля докладывает. Чтоб публика более догадками не мучалась. Молодец!
Да... давненько я тут таких ярких молодых дарований не читал. Да в таких количествах!
Что забавно - все из Питера! Заповедник?
A vy, talantlyvyi pisatel', otkuda? confused.gif
Участник оффлайн! Saveta

Краснодар



 прочитанное сообщение 01.12.2004 14:51     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #26 множественное цитирование

Автор - acher:
Не совсем в тему, но все же... Так режет слух!
Аллель - он мой! Кофе - он мой! ... Мужики они в русском языке...
Аллель, происходит от аллеломорфа, так что все же она, хотя вариант с мужским родом прижился больше.
Участник оффлайн! acher
Участник
Tomsk



 прочитанное сообщение 02.12.2004 17:10     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #27 множественное цитирование

allele, allelomorph - аллель, аллеломорф. Oдно из возможных структурных состояний гена; А. возникают в результате генных мутаций - потенциальное число А. для каждого гeна практически не ограничено; у диплоидных организмов ген может быть представлен лишь двумя А., локализованными на гомологичных участках гомологичных хромосом; иногда легко мутирующие гены могут быть представлены в популяции значительным числом А. - множественные А. <multiple alleles>; термин "аллеломорфы" предложен У.Бейтсоном и Дж.Сондерсом в 1902 и заменен на более простой термин "А." В.Иогансеном в 1909; следует учесть, что в последние годы слово "А." в русском языке строго мужского рода, хотя раньше его употребляли в женском роде.- аллель гена
- аллель дикого типа
- доминантный аллель
- истинный аллель
- кодирующий аллель
- кодоминантный аллель
- летальный аллель
- ложный аллель
- молчащий аллель
- неактивный аллель
- незаполненный аллель
- немой аллель
- нестабильный аллель
- нормальный аллель
- позиционный аллель
- потенциальный аллель
- пустой аллель
- рецессивный аллель
- сложный аллель
- сублетальный аллель
- функционально активный аллель
Участник оффлайн! vadimchik152a
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 04.10.2022 23:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #28 множественное цитирование

Значимость этих проблем настолько очевидна, что постоянный количественный рост и сфера нашей активности ни коим образом не противоречит нашей теории, а скорее наоборот, способствует улучшению форм воздействия. https://www.extendpua.org/profile/lesha77s/profile
Участник оффлайн! vadimchik152a
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 05.10.2022 01:17     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #29 множественное цитирование

Задача организации в особенности же реализация намеченных плановых заданий обеспечивает широкому кругу (специалистов) участие в формировании системы массового участия. https://www.kiseichu.org/profile/pasha12m/profile
Участник оффлайн! vadimchik152a
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 09.01.2023 00:00     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #30 множественное цитирование

С другой стороны рамки и место обучения кадров в значительной степени обусловливает создание позиций, занимаемых участниками в отношении поставленных задач. https://www.pickmemo.com/read-blog/116004
Участник оффлайн! vadimchik152a
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  07.03.2023 15:48     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #31 множественное цитирование

Further development of different forms of activity allows equal character to execute important tasks on development and analysis of necessary data for permission of situation on the whole. https://3dprintboard.com/member.php?105982-vlad69f7

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 29.03.24 17:27
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft