Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Fox Постоянный участник |
Весь сэмплинг 2003 года работает как часы - все по HWE, интенсивность аллелей в гетерозиготах одинакова. Берем материал 2004 года, приезжаем в Швецию (т.е. меняем все реактивы, включая буфер полимеразы) и получаем..... - в 40% случаев у гетерозигот одна аллель (ровно короткая или длинная) амплифицируется в несколько(до10) раз хуже другой!!!..... что делаем 1. повторяем - все повторяется у каждого моллюска 2. играем концентрацией ДНК на порядок туда-сюда НОЛЬ реакции 3. да праймеры тоже меняли - безрезультатно 4. уменьшаем температуру отжига и ... опаньки убогие аллели растут как на дрожжах... опс скажите вы - так ведь они поди неспецифичные! и будете может правы, но я никогда не поверю, что за 1 год во ВСЕЙ популяции (миллионы, а выборки - тысячи) мутировали фланкирующие участки половины аллелей, на этом мои мысли заканчиваются я полагаю что что-то в реакции Ваше мнение? возможно в субботу "дома" прогонят эти же образцы и что-то станец понятнее... |
genseq Постоянный участник |
на участках посадки праймеров часто встречаются SNP. При пониженной температуре отжига они себя не проявляют. В буферных смесях, содержащих энхансер, тоже. Проявиться они могли из-за замены буфера или повышения температуры отжига. Более прозаичное объяснение - различия в калибровке температурных режимов термоциклеров. |
Kiskin Постоянный участник |
|
Elena Voron Участник Новосибирск |
|
Den Постоянный участник |
|
Kiskin Постоянный участник |
|
Fox Постоянный участник |
2. На амплификатор тоже не хочется валить был ABI 2700 сейчас Eppendorf тоже не старый, не верю в принципиальные отличия между этими машинками 3. Популяция одна и та же! (не разные этносы 4. Итак буфер - верю в SNP, тем более что локус заимстован у близкого вида. Сейчас используется Takara полимераза с буфером простым как пробка 10mM Tris-HCl(pH 8.3); 50mM KCl; 1,5mM MgCl2) Раньше был Сибэнзим c буфером 60 mM Tris-HCl (pH 8.5); 25 mM KCl; 1.5 mM MgCl2; 10 mM 2-меркаптоэтанол; 0.1% Тритон X-100 Мне кажется что и тритон и меркаптоэтанол только стабилизируют фермент? Могут ли они приводить к менее специфичному связыванию с матрицей, т.е. к наблюдаемому ранее эффекту? |
le lapin Постоянный участник |
Автор - Fox: Зря не веришь, Миша. У них наверняка разный ramping (скорость изменения температуры). 2. На амплификатор тоже не хочется валить был ABI 2700 сейчас Eppendorf тоже не старый, не верю в принципиальные отличия между этими машинками Кстати, если дело именно в этом, попробуй просто увеличить время отжига. |
VKV Участник |
|
Fox Постоянный участник |
а как насчет Тритона и меркаптоэтанола? |
acher Участник Tomsk |
Настораживает...однако. При уменьшении T отжига ... специфичность "обычно" падает... Возможно, в Швейцарии Вы "по-настоящему" амплифицируете, то, на что сделаны праймеры... Дома же -амплифицировали, то, на что вследствие конформации садились праймеры... Не знаю, возможно ли пройтись по геному ваших "улиток" заново проверив подбор праймеров... вряд ли... Это худшее что может быть. Надеюсь, что (соглашусь с предыдущими участниками) виноват рэмпинг... Сравните его значение у ваших программ и амплификаторов вообще. |
Fedor K. Москва |
|
AVS Постоянный участник UK - Russia |
Тритон и меркаптоэтанол - для лучшей растворимости. Первый ещё может белковые примеси денатурировать, а второй S-S связи рвёт у цистинов(при условии, что для фермента это не важно). |
Fox Постоянный участник |
|
acher Участник Tomsk |
Аллель - он мой! Кофе - он мой! ... Мужики они в русском языке... |
Fox Постоянный участник |
ABI 2700 - 1c/sek Eppendorf Mastercycler - 3c/sek вот как - видимо сваливаются они, если так реактивно нагревать. Попробую уменьшить скорость - посмотрим что получится. |
Den Постоянный участник |
|
Fox Постоянный участник |
А в Москве - маркЕр! К сабжу - уменьшение рампинга до 1гр/сек при нагреве после отжига реально помогает! Локус(ы) вообще прикольный - амплифицируется несколько локусов (семейство?) микросателлитов разных размеров. Все вариабельные. Надо заказать праймеры немеченные попробовать секвенировать - интересено |
le lapin Постоянный участник |
|
Den Постоянный участник |
Да, относительно маркерОв и чипОв, тоже очень забавно. |
Den Постоянный участник |
|
|
Да... давненько я тут таких ярких молодых дарований не читал. Да в таких количествах! Что забавно - все из Питера! Заповедник? |
Fox Постоянный участник |
Спасибо dear <-гость-> за ценные советы высказанные Вами в ответ на мой, как Вы правильно заметили, элементарный вопрос. Надеюсь и в дальнейшем на Вашу поддержку и сочувствие. Разрешите в силу Вашей анонимности называть Вас Dr. R.Axel, или Dr. L.B.Buck (if you are lady). |
Aks Постоянный участник |
Автор - <опять пришёл>: A vy, talantlyvyi pisatel', otkuda?
Den нашел брата! Старшего. Этот инструкции читает только если важный експеримент не выходит. И честно опосля докладывает. Чтоб публика более догадками не мучалась. Молодец! Да... давненько я тут таких ярких молодых дарований не читал. Да в таких количествах! Что забавно - все из Питера! Заповедник? |
Saveta Краснодар |
Автор - acher: Аллель, происходит от аллеломорфа, так что все же она, хотя вариант с мужским родом прижился больше.
Не совсем в тему, но все же... Так режет слух! Аллель - он мой! Кофе - он мой! ... Мужики они в русском языке... |
acher Участник Tomsk |
- аллель дикого типа - доминантный аллель - истинный аллель - кодирующий аллель - кодоминантный аллель - летальный аллель - ложный аллель - молчащий аллель - неактивный аллель - незаполненный аллель - немой аллель - нестабильный аллель - нормальный аллель - позиционный аллель - потенциальный аллель - пустой аллель - рецессивный аллель - сложный аллель - сублетальный аллель - функционально активный аллель |
vadimchik152a Постоянный участник |
|
vadimchik152a Постоянный участник |
|
vadimchik152a Постоянный участник |
|
vadimchik152a Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |