molbiol.ru -> Праймеры для оценки экспрессии генов

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Праймеры для оценки экспрессии генов -- нужна небольшая консультация --

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

Cinderella
Постоянный участник
где-то в Сибири

12.01.2009 09:16

URL #1

Вопрос многим может показаться диким, но нужно кое-что проянить.

вкратце: ставлю реал тайм ПЦР для оценки экспрессии генов с использованием TagMan. пробоподготовка: выделяю тотальную РНК, с нее получаю кДНК в реакции ОТ (использую рандом9). кДНК идет в саму ПЦР.
вопрос: праймеры подбирают с mRNA целевого гена или с DNA того же гена??

и еще

: хочу попробовать перейти на сайбр грин. можно ли использовать те же праймеры (без зонда естесттно) и тот же набор для ПЦР для ТagMan (вроде в наборе ничего такого нет, на мой взгляд). нужен ли подбор условий ПЦР по новой?

большое спасибо.

fbb
Участник

12.01.2009 09:31

URL #2

днказой обрабатываете выделенную рнк, чтобы остатки геномной днк убить? или у Вас праймеры на экзон-интрон подобраны, чтобы только с мРНК шло?

Cinderella
Постоянный участник
где-то в Сибири

12.01.2009 10:44

URL #3

причем тут убить геномку?
для обычной ПЦР праймеры берут с ДНК, а для оценки экспрессии гена? праймеры писать с mRNA? или также с ДНК?
я вообще со статей брала и из базы. это не относиться к вопросу.
вопрос тот же с какой цепи писать праймеры?

и еще - где можно посмотерть где находяться интроны и экзона на цепи? ссылка или програма. плиииз.

и еще кто нибудь может мне сказать по поводу качества праймеров? можно ли такие использовать?
на актин

Сообщение было отредактировано Cinderella - 12.01.2009 10:46

Файл/ы:

____________.htm
размер: 46.18к
кол-во скачиваний: 10
12.01.2009 — 26.01.2009

________________________________..txt
размер: 1.09к
кол-во скачиваний: 6
12.01.2009 — 26.01.2009

____________.htm
размер: 128.38к
кол-во скачиваний: 5
12.01.2009 — 26.01.2009

Cinderella
Постоянный участник
где-то в Сибири

12.01.2009 12:30

URL #4

плииииззззззззззз

semi
Постоянный участник
Москва

12.01.2009 14:48

URL #5

Не совсем поняла вопроса, да я и сама не шибко большой спец.
Данные программы "Primer-BLAST: Finding primers specific to your PCR template (using Primer3 and BLAST). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-b...LOC=BlastHomeAd :
Первый набор праймеров (Forward primer CCTTCACTGCCTGGTGTAAC; Reverse primer TTCCTATGGGGTCATCCTTG )соответсвует mRNA Homo sapiens actinin, alpha 2 (ACTN2), mRNA , положение 332-835, длина ПЦР-продукта 504, экзоны 2-6. Видимо, можно получить ПЦР продукт с мРНК actinin, alpha 3 (ACTN3), с той длиной продукта, разница в буквах по Forward primer -1 буква, по Reverse primer - 2 буквы, одна на 3' конце. Ваша проба AGCAAAGGGGTGAAACTGGTGTC комплиментарна как мРНК актинина 2, так мРНК актинина3 (в последнем случае есть несовпадение двух букв).
Второй набор - практически все то же самое то же самое, но длина продукта 268, положение 370-637, опять есть вероятность получить ПЦР продукт с мРНК actinin, alpha 3 (ACTN3), с той длиной продукта.

ДНК последовательность NC_000001 не нужна, т.к. кДНК строится по мРНК, где уже нет интронов, у вас продукт включает несколько экзонов. ДНКазить вроде бы не нужно, т.к. с геномной ДНК продукта вроде бы никакого не должно получаться.

Я бы (от греха подальше) брала другой набор праймеров, для которых нет вероятности поднять продукт другого гена.

Поблагодарили (1): Cinderella

ship
Постоянный участник
Moscow

12.01.2009 15:15

URL #6

праймеры подобрать не могут, зато РЕАЛ-ТАЙМ ПЦР делают!

Ъ
IP-штамп: frzi5.baR3A8I
гость

12.01.2009 16:02

URL #7

(ship @ 12.01.2009 14:15)

праймеры подобрать не могут, зато РЕАЛ-ТАЙМ ПЦР делают!

Всяко бывает. В наше время начинать с конца - самое то...

А semi молодец не поленилась побластить и даже рекомендации дает.
По мне: прраймеры как праймеры.

Можно и с сибром использовать.
http://www.gene-quantification.info/
http://normalisation.gene-quantification.info/

Cinderella
Постоянный участник
где-то в Сибири

13.01.2009 07:18

URL #8

semi
да я замучилась праймеры искать. такая фигня все. а вроде эти ничего.

ship
праймеры подобраны, но они не работают. есть праймеры взятые со статей или с баз праймер 3. проверила - очень плохие. там вообще не известно откуда взяты...

чайник555
Постоянный участник
Сибир-р-р-ръ

13.01.2009 07:48

URL #9

(ship @ 12.01.2009 12:15)

праймеры подобрать не могут, зато РЕАЛ-ТАЙМ ПЦР делают!

Когда прибор не работает, приходится читать инструкцию...
Если опыт получается с первого раза, значит он проведён неверно...

Cinderella
Постоянный участник
где-то в Сибири

13.01.2009 09:01

URL #10

(чайник555 @ 13.01.2009 07:48)

если тебе пофиг на результаты - можно и шлепать то что получается
а можно вообще нарисовать и не париться

Сообщение было отредактировано Cinderella - 13.01.2009 09:01

Kiskin
Постоянный участник

13.01.2009 10:55

URL #11

Ну точно тот же вопрос той же участницей был задан полгода назад. Cinderella, Вам это не странно ?

Cinderella
Постоянный участник
где-то в Сибири

20.01.2009 06:41

URL #12

странно, но вопрос не такой был и не про это. просто мне так никто и не сказал - правильно я делаю или нет. все только умничают и ехидничают, за очень редким , очень редким исключением, за что им глубокое спасибо.

Derro
Постоянный участник

21.01.2009 17:14

URL #13

Синдерелла, ну а что вы хотели? В принципе, вопрос "праймеры подбирают с mRNA целевого гена или с DNA того же гена" адекватен и правилен. Но! Человека не знающего ответа на этот вопрос я бы ни к одному реал-тайму бы не допустил. Не сочтите за оскорбление, но чтобы ответить на этот вопрос достаточно знать лишь теорию ПЦР и общий курс молекулярной биологии на троечку. Как же тут не ехидничать, если вам проще поморать экран, чем на пару минут включить голову.

Без обид.

Поблагодарили (1): ship

Statin
Постоянный участник

21.01.2009 19:20

URL #14

Хорошо, что semi проверил праймеры и они дествительно чему-то соответствуют, зачастую в статьях намеренно дают неправильную последовательность праймеров, а в базы сливают всякие абортусы (с большой кучей вторичных структур).
Подбирайте праймеры сами, берите мРНК и подбирайте на стыке экзонов, потом проверяйте по ДНК, желательно, чтобы продукта не было или был, но очень длинный.

Начинающий
Участник

22.01.2009 13:31

URL #15

короче делаешь так, заходишь в pubmed вводишь название гена, далее слева выбираешь nucleotide (по умолчанию стоит pubmed) делаешь поиск, выбираешь нужный организм, mus musculus например если с мышами, идешь ниже, там должно быть mRNA and Protein(s) в этой колонке стоит gene ID базы данных NCBI обычно это что-то типа NM_079486.3 копируешь эту штучку. Актин не очень удачный пример, так как много их сильно, но неважно...
Далее открываешь эксплорер (firefox, whatever) idtdna.com там выбираешь SciTools потом PrimerQuest, далее думаю разберешься, если нет пиши объясню детали.
Эта программа онлайн для дизайна праймеров, фактически из базы данных NCBI ты вводишь последовательность гена а прога тебе уже сама подбирает праймеры. Праймеры сделанные таким образом работают!!! проверено!!!
и не надо будет тебе заморачиваться на счет DNA mRA и тд.
На счет TaqManа, праймеры может и подойдут к SYBR, но обычно они в одной смеси с пробой продаются поэтому разделить их нельзя. Попробуй сначала сделать SYBR это примерно в 5-10 раз дешевле чем TaqMan. Если что-то не работает, то возможно проблема с cDNA у меня иногда быват, что используя одну и ту же методику получения cDNA реал тайм почему-то не работает, проще выкинуть и сделать новую.

Derro
Постоянный участник

22.01.2009 17:05

URL #16

м...да... А я бы посоветовал сначала с листком бумажки и карандашиком посидеть, чтобы на веки вечные в голову вбилось. Начинающий, а не подскажите какойнить он-лайн тул для анализа полученных Синдереллой результатов?

Начинающий
Участник

22.01.2009 18:28

URL #17

так а чего там собственно считать, взял средние значения C(T) в формулу подставил да и все. Я обычно в exele делаю, хотя есть у меня знакомый пользуется програмулиной одной не помню как называется, но собственно фишка проги в том, что там эта формула уже вбита и после подстановки средних значений C(T) она выдает результат. Единственное что могу посоветовать еще это делать triplicates, даже не знаю на русском этого слова

)) в общем с одной и той же пробой минимум три раза повторить эксперимент просто, чтобы совесть чиста была

но я думаю это и так все знают...

svetbatalia

28.03.2021 23:40

URL #18

(Cinderella @ 13.01.2009 08:18)

А как вы по статьям искали? Я понимаю, что вопрос глупый, но мы по факту еще не проходили, а на проекте требуют. Я пыталась искать через статьи на pubmed и nbci, но по факту не нашла. Такое чувство, что просто неправильно делаю

watchesbiz
Постоянный участник

27.09.2021 17:03

URL #19

https://app.ex.co/stories/bestreplicawatche...-regime-for-you
https://rolexrelicawatches.hpage.com/replica-watches-uk.html
https://www.cgmimm.com/articles/hints-to-he...lica-watches-uk
https://www.deviantart.com/fakerolexwatches...es-UK-871090193
https://replicawatches24.exposure.co/best-r...eplicawatches24
https://knowyourmeme.com/users/replicawatchesuk
https://www.scoop.it/topic/bestreplicawatch...ica-rolex-watch
https://uberant.com/article/1268140-hints-o...ca-rolex-watch/
https://devpost.com/watcheshutuk
https://www.ted.com/profiles/26540630/about
https://drive.google.com/file/d/1uTx90WraSJ...iew?usp=sharing
https://ibb.co/hgfZwb0
https://writer.zohopublic.com/writer/publis...10192bd4c742ceb
https://replicawatches24.mystrikingly.com/b...ica-rolex-watch
https://my.desktopnexus.com/ReplicawatchesU...a-rolex--31049/
https://sway.office.com/Tqm7mC7s0VWLhKAl

watchesonline89
Постоянный участник

24.12.2022 11:47

URL #20

https://omegawatches89.mystrikingly.com/
https://www.deviantart.com/omegawatches89/j...pular-930508248
https://eatsleepride.com/c/383270
https://fortunetelleroracle.com/fashion/ama...s-online-737627
https://www.intensedebate.com/people/omegawatches89
https://fortunetelleroracle.com/fashion-acc...-popular-737613
https://anotepad.com/notes/ykiydhnj
https://medium.com/@omegawatches89/amazing-...ne-b4863ed55af0
https://omegawatches90.mystrikingly.com/
https://62e8ce2ae5d50.site123.me/blog/repli...ve-items-online
https://62e8da780bf7c.site123.me/
https://padlet.com/omegawatches89/9ibenzfwbcer7k71
https://omegawatches89.simplesite.com/452939012
https://62e8da780bf7c.site123.me/blog/excit...-replica-online
https://62e8ce2ae5d50.site123.me/blog/advan...replica-watches

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.