 * |   |
|
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда |  Zbio-wikiNG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: |
|
Правила
* eFluor-450 -- высокий background --
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.
   |
 petrПостоянный участник  |
 08.11.2013 23:26
Купил недавно эту краску, попробовал сделать по протоколу пилотный эксперимент, получил довольно высокий background в живых клетках. Вопрос: Имеет ли смысл титровать (добавлять меньше краски) или инкубировать меньше времени. Может еще какими нибудь параметрами поиграть (температура, и т.д.)? Есть ли какие-то еще тонкости? Уж больно не хочется тратить время на оптимизацию заранее известных вещей. Заранее большое спасибо! ЗЫ: использовать PI staining не могу, т.к. мой драг накапливается в клетках и светит, зараза, на всех каналах кроме UV Сообщение было отредактировано petr - 09.11.2013 00:20 |
|
arndt Постоянный участник |
08.11.2013 23:52
(petr @ 09.11.2013 00:26)  Народ, если у кого есть опыт покраски клеток этим реагентом, подскажите плс. Купил недавно эту краску, попробовал сделать по протоколу пилотный эксперимент, получил довольно высокий бацкгроунд в живых клетках. Вопрос: Имеет ли смысл титровать (добавлять меньше краски) или инкубировать меньше времени. Может еще какими нибудь параметрами поиграть (температура, и т.д.)? Есть ли какие-то еще тонкости? Уж больно не хочется тратить время на оптимизацию заранее известных вещей. Заранее большое спасибо! ЗЫ: использовать ПИ стаининг не могу, т.к. мой драг накапливается в клетках и светит, зараза, на всех каналах кроме УВ если живые должны пампин аут при 37 а что за краска у кого купил |
|
arndt Постоянный участник |
08.11.2013 23:58
(petr @ 09.11.2013 00:26) Народ, если у кого есть опыт покраски клеток этим реагентом, подскажите плс. Купил недавно эту краску, попробовал сделать по протоколу пилотный эксперимент, получил довольно высокий бацкгроунд в живых клетках. Вопрос: Имеет ли смысл титровать (добавлять меньше краски) или инкубировать меньше времени. Может еще какими нибудь параметрами поиграть (температура, и т.д.)? Есть ли какие-то еще тонкости? Уж больно не хочется тратить время на оптимизацию заранее известных вещей. Заранее большое спасибо! ЗЫ: использовать ПИ стаининг не могу, т.к. мой драг накапливается в клетках и светит, зараза, на всех каналах кроме УВ пет лен по гооглу бегат выложи краску наверняка старый аналог какойнибут от молекулар пробс |
|
petr Постоянный участник |
09.11.2013 00:13
Он типа с белками связывается. У живых будет красить только те, что на мембране сидят, памп аута не будет, т.к. он связывается, как я понимаю ковалентно. В мертвых будет заходить внутрь и красить все и ярче. |
|
petr Постоянный участник |
09.11.2013 00:16
If the percentage of dead cells is expected to be less than 5%, then it is recommended to take a small aliquot of cells and heat them at 65°C for 1 minute then immediately place on ice for 1 minute. After this treatment, the heat-killed cells can be combined 1:1 with live cells and then stained with the Fixable Viability Dye. Это значит он там хороший фон дает на живых... Интересно, как мне потом дискриминировать? |
|
petr Постоянный участник |
09.11.2013 00:32
|
|
arndt Постоянный участник |
09.11.2013 05:19
(petr @ 09.11.2013 01:32) Может тупо ДАПИ красить и немедленно на факс?если факс с уф (360 нм) можно хехстом если для живых - но в проблему не врубился 
|
|
arndt Постоянный участник |
09.11.2013 05:31
(petr @ 09.11.2013 01:32) Может тупо ДАПИ красить и немедленно на факс?если в среду с сывороткой дапи быстро не полезет - хотя лив-деад дофига красок |
|
arndt Постоянный участник |
09.11.2013 06:07
(petr @ 09.11.2013 01:32) Может тупо ДАПИ красить и немедленно на факс?зачем быстро - капнул ДАПИ живым - крутанул в ПБС и медленно на ФАКС
|
|
arndt Постоянный участник |
09.11.2013 06:18
(petr @ 09.11.2013 01:32) Может тупо ДАПИ красить и немедленно на факс?факсов на рынке под ДАПИ раз-два и обчелся - позвони Дяде Факсеру
|
|
petr Постоянный участник |
09.11.2013 16:33
(arndt @ 09.11.2013 04:18) факсов на рынке под ДАПИ раз-два и обчелся - позвони Дяде Факсеру У нас есть один в фасилити, который дает 407нм эксайтейшн. Для ДАПИ вроде подойдет. (arndt @ 09.11.2013 03:19) если факс с уф (360 нм) можно хехстом если для живых - но в проблему не врубился Да даже не то, чтоб проблема. Надо просто посчитать сколько получается дохляка после обработки двумя драгами в комбинации, один из которых накапливается в клетках и светится на всех каналах (соответвтвенно в живых, обработанных таким драгом весь пик съезжает вправо). Поэтому мне (и факсу) подходит краска только которая имеет 407 excitation и 450 emission. (arndt @ 09.11.2013 04:07) зачем быстро - капнул ДАПИ живым - крутанул в ПБС и медленно на ФАКС Ну быстро, типа для того, что ДАПИ может проходить и в живые, но гораздо медленнее, чем в мертвые. |
|
petr Постоянный участник |
09.11.2013 16:37
(arndt @ 09.11.2013 03:31) если в среду с сывороткой дапи быстро не полезет - хотя лив-деад дофига красокВ протоколе, вроде как, в присутствии сыворотки красить не велят. |
|
arndt Постоянный участник |
09.11.2013 16:54
(petr @ 09.11.2013 17:37) В протоколе, вроде как, в присутствии сыворотки красить не велят.не понятно тогда межу кипячеными клетками и живыми сколко лог на факсе |
|
arndt Постоянный участник |
09.11.2013 17:02
(petr @ 09.11.2013 17:37) В протоколе, вроде как, в присутствии сыворотки красить не велят.почему обычный этидий пропидий не работают когото посадил в красный канаал |
|
arndt Постоянный участник |
09.11.2013 17:05
(petr @ 09.11.2013 17:37) В протоколе, вроде как, в присутствии сыворотки красить не велят.какой у тебя факс |
|
arndt Постоянный участник |
09.11.2013 17:09
(petr @ 09.11.2013 17:37) В протоколе, вроде как, в присутствии сыворотки красить не велят.у меня партек с уф диодом мог бы прогнат дапи хехст но деалеко
|
|
petr Постоянный участник |
09.11.2013 17:32
(arndt @ 09.11.2013 15:02) почему обычный этидий пропидий не работают когото посадил в красный канаалДа говорю ж, драг (сунитиниб) сцуко, светится и в красном и в зеленом, и в желтом Он в клетках накапливается сильно, и дает false-positive signalСообщение было отредактировано petr - 09.11.2013 17:33 |
|
arndt Постоянный участник |
10.11.2013 00:09
(petr @ 09.11.2013 18:32) Да говорю ж, драг (сунитиниб) сцуко, светится и в красном и в зеленом, и в желтом Он в клетках накапливается сильно, и дает false-positive signalяб тогда в дапи хехст похоже тут ловить нечего
|
|
petr Постоянный участник |
10.11.2013 01:07
|
|
arndt Постоянный участник |
10.11.2013 09:09
(petr @ 10.11.2013 02:07) Спасиб, попробуюпод дапи хехст цитометров мало обычный факс не пойдет |
|
ship Постоянный участник Moscow |
10.11.2013 22:48
|
|
petr Постоянный участник |
11.11.2013 08:59
Сообщение было отредактировано petr - 11.11.2013 09:00 |
|
LMP Постоянный участник |
14.11.2013 13:40
Если монослой, то можно хехстом прямо в лунку со средой капнуть и 10мин и под микроскоп. Если нужно % дохлых отдиференцировать, то глазом их можно отличить. Хотя конечно от культуры зависит... Сообщение было отредактировано LMP - 14.11.2013 13:52 |
|
petr Постоянный участник |
14.11.2013 23:54
|
|
petr Постоянный участник |
14.11.2013 23:55
|
|
ship Постоянный участник Moscow |
15.11.2013 00:58
|
|
petr Постоянный участник |
15.11.2013 01:33
(ship @ 14.11.2013 22:58) нуачто насчет такого кита ?? тут и некроз и апоптоз вместе.Посмотрел, спасибо. Мне не очень он подойдет, т.к. я апоптоз TUNEL^ом смотрю и факсом меряю, некро(пто?)з тоже хотелось бы потом на факсе померить. |
|
ship Постоянный участник Moscow |
15.11.2013 02:00
|
|
arndt Постоянный участник |
15.11.2013 09:59
(petr @ 15.11.2013 00:54) Монослой. Но мне все равно их снимать. Глазом все и так видно, просто хочу посчитать нга факсе. В статье ведь про глаз не напишешь потряси слегка в Версене - апоптоз пойдет в Версен - живые останутся на пластике |
|
LMP Постоянный участник |
15.11.2013 10:08
|
|
LMP Постоянный участник |
15.11.2013 10:11
Сообщение было отредактировано LMP - 15.11.2013 10:11 |
|
LMP Постоянный участник |
15.11.2013 12:09
(LMP @ 15.11.2013 08:08) а что в статью фотки с микроскопа не принимают разве?имел ввиду флуоресцентный микроскоп)) |
|
Tom1 Постоянный участник |
 15.11.2013 18:20
Neuronal viability was assessed by quantifying apoptotic nuclei following the treatments. Cells were fixed and stained with DNA-binding dye Hoechst 33258 (1μg/ml; Sigma), and the percentage of cells with apoptotic nuclei was calculated as described previously [36]. Nuclear staining was viewed and photographed using a Nikon Eclipse E800 fluorescence microscope equipped with a Spot digital camera and software. Apoptosis was also determined by immunoblot analysis for activated (cleaved) caspase-3 in cellular extracts from corresponding neuronal cultures. Extract from staurosporine-treated apoptotic Jurkat cells (Sigma) was used as a positive control" |
|
petr Постоянный участник |
15.11.2013 19:46
(LMP @ 15.11.2013 08:08) а что в статью фотки с микроскопа не принимают разве?Это не количественный анализ. В принципе конечно можно и микроскопом посчитать, но зачем усложнять себе жизнь? |
|
petr Постоянный участник |
15.11.2013 19:47
(LMP @ 15.11.2013 08:11) кстати, при съеме драг-обработанных клеток, немалый процент клеток дохнет от избыточной нагрузки (опять же от линии зависит, фибробластам вообще пофиг)В моем случае - не успевают
|
|
petr Постоянный участник |
15.11.2013 19:59
Smpls: 1. medium - 1-3% дохляка допускается 2. Drug A - 5-7% апоптоза/дохляка 3. Drug B - 5-10% апоптоза/дохляка 4. Drug C - 4-5% апоптоза/дохляка 5. Drug A+B - 60-70% апоптоза 6. Drug A+C - 4-5% апоптоза (TUNEL assay) 7. Drug A+C - 60-80% некроза/некроптоза (eFluor450; хехст или DAPI) 8. Drug A+B+ Z-VAD-FMK -> 4-5% апоптоза (TUNEL assay) 9. Drug A+B+ Z-VAD-FMK -> 60-80% некроза/некроптоза (eFluor450; хехст или DAPI) Примерно так. Простой эксперимент, никакой высокой науки в нем нету. Надо всего лишь показать, что клетки все равно дохнут, поскольку драги B и С действуют примерно на одно и тоже. |
|
LMP Постоянный участник |
15.11.2013 20:32
Или драг мешает? |
|
LMP Постоянный участник |
15.11.2013 20:38
|
|
petr Постоянный участник |
16.11.2013 01:47
(LMP @ 15.11.2013 18:32) А это "одно и тоже" покрасить нельзя? Или драг мешает? Не, это просто ингибитор одной киназы. Покрасить ее таргеты можно (т.е. такая картинка уже есть). Мне просто нужна картинка ФАКСа в дополнению ко всему остальному. |
|
arndt Постоянный участник |
16.11.2013 06:40
(petr @ 16.11.2013 02:47) Не, это просто ингибитор одной киназы. Покрасить ее таргеты можно (т.е. такая картинка уже есть). Мне просто нужна картинка ФАКСа в дополнению ко всему остальному.нифига не понял - дохлые живые у меня биорадовская машинка с трипановым на чипах - студенты в селл културе как стандарт
|
|
arndt Постоянный участник |
16.11.2013 06:48
|
|
LMP Постоянный участник |
16.11.2013 23:29
(petr @ 15.11.2013 23:47) Мне просто нужна картинка ФАКСа в дополнению ко всему остальному.это рецензенты что ли придираются? |
|
petr Постоянный участник |
17.11.2013 02:43
|
|
petr Постоянный участник |
17.11.2013 02:45
(arndt @ 16.11.2013 04:48) Хорошая машинка. дорговата правда. Сообщение было отредактировано petr - 17.11.2013 02:47 |
|
arndt Постоянный участник |
18.11.2013 09:30
(petr @ 17.11.2013 03:45) Хорошая машинка. дорговата правда.чем это она дороговата ? 
|
|
watchesbiz Постоянный участник |
04.12.2021 08:02
? |
|
watchesonline89 Постоянный участник |
28.12.2022 11:13
|
| « Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |
 |
· Викимарт - все интернет-магазины в одном месте · Доска объявлений Board.com.ua ·
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---
Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Powered by Invision Power Board(Trial) v2.0.0 © 2024 IPS, Inc.