Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Liora |
|
MMM Постоянный участник |
Кстати, ооочень простое решение ИФА(иммуноферментный анализ) на IgG человека. Практически 100% подтверждение, что вы имеете дело с кровью и с кровью не кого-нибудь, а человека.
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
"Произвожу определение крови в москитах"... , А можно другими словами? Длинные каникулы вредят не только печени...
|
vb Постоянный участник |
|
borigv Постоянный участник г. Саратов |
|
le lapin Постоянный участник |
Ответ на вопрос дал МММ. |
vb Постоянный участник |
(le lapin @ 23.01.2017 07:46) Задача как раз вполне понятна и описана в первом посте. Человеку надо понять, пили москиты кровь человека или нет. Если делать анализ при помощи ПЦР, велика вероятность что человеческие ПЦР-продукты являются результатом контаминации. ДНК человека м.б. занесена при сборе материала или при его анализе. Ответ на вопрос дал МММ. Нда? ну перечитайте еще вопрос. с проблемой человек/не человек еще понятно, А вот кровь или не кровь... а что там еще может быть? Куски коленного сустава что ли? Ну лимфа еще, наверное... не уверен. Но тут Игг не поможет. |
le lapin Постоянный участник |
А перечитать вопрос советую вам. Там все ясно как день. Не только я его понял
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Liora @ 20.01.2017 12:53) Скажите пожалуйста, как можно выявить источник человеческой ДНК, есть ли способ понять что ДНК из крови или из клеток? Есть ли какие-то маркеры в чистом ДНК или можно провести тест еще до экстракции? Произвожу определение крови в москитах, бывают контаминации с человеческой ДНК. Хочу знать наверняка, что источник ДНК из крови. Сто раз перечитал... Из каких клеток??? О чем речь? Произошла, видимо, самая банальная контаминация и тут же самые безумно-заумные выводы! |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(le lapin @ 23.01.2017 19:33) Тот кто собирает образцы или тот, кто их анализирует может занести свою ДНК например, с чешуйками кожи или мельчайшими капельками слюны. Задача, очевидно, отличать такую контаминацию от возможной человечской крови в кишке москита. А перечитать вопрос советую вам. Там все ясно как день. Не только я его понял Чешуйчатые люди облизывают москитов... |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
|
Liora |
|
Liora |
(-Ъ- @ 24.01.2017 16:48) Извините, я не из России, не очень поняла ваш вопрос. Вы имеете ввиду, поднимают ли мои праймеры определенный вид носителя днк или все подряд? Если да, то Все подряд |
Panaev Постоянный участник |
(Liora @ 30.01.2017 22:57) Друзья, спасибо за отзывы. Le lapin совершенно верно вам пояснил. У меня завал. Работаю , как в операционной, 2 пары перчаток, халат, первая пара перчаток обрабатывается хлоркой. Все коробочки, стенды, пробирки обрабатываютя хлоркой и проходять 20 мин УФ. Но все равно получаю контаминацию, т.е. мои отрицательные контроли выходят положительными на человеческую днк. Хотя и не все. Куча проверок показывает, что контаминация скорее всего во время подготовки к пцр. Что еще можно сделать, чтобы предотвратить контаминацию? Может у кого есть ссылка на руководство по работе с такими образцами? Спасайте Ну перчатки с коробочками это понятно. Помещения, воздух у вас что из себя представляют? |
Liora |
(Panaev @ 31.01.2017 13:27) Все стадии работы разделены, в разных комнатах и даже этажах. Днк добавляю в биологической "клетке", простите не знаю как по русски называется, с вытяжкой, после очистки и уф. Сегодня помимо всего одела маску |
MMM Постоянный участник |
2)Очень похоже, что у вас идет загрязнение амплифицированным фрагментом. Он может быть в одном из реактивов: Буфер(вода), полимераза, праймеры, dNTP. Он может быть в пипетках- сэмплерах. Может быть загрязнение помещения(но это менее вероятно) И никакаие вот: "есть ли способ понять что ДНК из крови или из клеток? Есть ли какие-то маркеры в чистом ДНК или можно провести тест еще до экстракции? " Вам не помогут. Либо вы обновляете все разом. либо действуете методом исключения. Сообщение было отредактировано MMM - 31.01.2017 14:10
|
Panaev Постоянный участник |
(Liora @ 31.01.2017 13:53) Все стадии работы разделены, в разных комнатах и даже этажах. Днк добавляю в биологической "клетке", простите не знаю как по русски называется, с вытяжкой, после очистки и уф. Сегодня помимо всего одела маску Какие варианты? 1. Целевой фрагмент нужно выбирать с низкой копийностью. 2. Пробоподготовку проводить в помещениях не ниже класса B с соответствующей спецодеждой. Контроль реактивов и расходников подразумевается. В принципе, крови в москитах достаточно для ИФА. Поэтому лучше делать его. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Я тоже как и МММ склонен к тому, что контаминация самая банальная - ампликонами. Сначала загадили пипетку, ну а затем все компоненты реакции постепенно. Это пожар! Меняйте все. ПЫС: Интересно в какой стране девушка работает, где плохо говорят по-русски. |
MMM Постоянный участник |
А где еще могут знать русский, но не до конца. |
borigv Постоянный участник г. Саратов |
Вероятно есть некая пороговая концентрация ампликонов которая периодически выдает положительный сигнал а периодически нет, но для меня ситуация кажется странной. Я привык что уж если контаминация ампликонами то вылазит всегда. Прежде чем обсуждать контаминацию, на мой взгляд, стоит поинтересоваться системой контролей в данной работе. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Гоголь @ 01.02.2017 09:45) Комары, москиты - плохая модель. Лучше всего на клопах с одного, скажем, дивана. А если праймеры от высококопийных Alu-повторов, которых на геном тысячи (!!!), причем по всем хромосомам - туши весла. Бороться с этим в условиях ТС нереально. А мои вопросы к ТС остаются в силе. |
Liora |
|
Liora |
Я тоже как и МММ склонен к тому, что контаминация самая банальная - ампликонами. Сначала загадили пипетку, ну а затем все компоненты реакции постепенно. Это пожар! Меняйте все. ПЫС: Интересно в какой стране девушка работает, где плохо говорят по-русски. [/quote Праймеры к 12S and 16S mitochondrial rRNA gene, реактивы заказываются в местных проверенных фирмах. Все загрязнения поднитмаются давольно таки поздно (Ст=35-38-39), Real-time PCR. Заражение ампликонами возможно, но очеееень маловероятно. У нас строго с соблюдением поядка комнат. А идея завести свой набор пипеток и вычленить отдельный угол тоже уже родилась |
Liora |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Итак, встречный вопрос: Вы уверены в том что сигнал на реал тайм специфический, анализируете ли Вы после PCR продукты плавлением или используете зонды? Митохондрий то самих на клетку сотни, а это уже много копий. Поэтому и спрашивал про копийность матрицы. Жду ответа. |
Liora |
|
borigv Постоянный участник г. Саратов |
Я предполагал что загрязнения поступают с материалом (опыт работы в лаборатории по определению личности говорит мне что мало мест на этой планете не "запачканых" ДНК человека), но Ваш опыт с водой отбрасывает это предположение. |
Liora |
(-Ъ- @ 01.02.2017 12:40) Итак, встречный вопрос: Вы уверены в том что сигнал на реал тайм специфический, анализируете ли Вы после PCR продукты плавлением или используете зонды? Митохондрий то самих на клетку сотни, а это уже много копий. Поэтому и спрашивал про копийность матрицы. Жду ответа. Cпасибо вам за помощь и за статью, обязательно прочту. Извините, я не поняла вашего вопроса. Что такое плавление и зонды? Как это на английском? |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Почитайте здесь, заодно русскую терминологию освоите: А совершенствуйтесь на этом сайте: А вообще в инете очень много веселых картинок про реал тайм PCR, надеюсь, найдете что по душе для самообразования. По сути темы подумал... ведь у Вас праймеры (зонды)могут быт не супер специфичными и они могут давать перекрестную реакцию. Для начала можно повысить темп. отжига, а лучше выставите последовательности праймеров (зонда) сюда на форум для обсуждения. Возможно, праймеры Ваши из той статьи, что я давал выше. |
Liora |
(-Ъ- @ 02.02.2017 13:04) По сути темы подумал... ведь у Вас праймеры (зонды)могут быт не супер специфичными и они могут давать перекрестную реакцию. Для начала можно повысить темп. отжига, а лучше выставите последовательности праймеров (зонда) сюда на форум для обсуждения. Возможно, праймеры Ваши из той статьи, что я давал выше. Я использую HRM mix (как зонд). |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Честно, устал вытягивать из Вас инфо. Нужны сиквенсы праймеров и протокол хотя бы краткий над чем Вы работаете. Можете выкладывать на инглиш, на идиш (иврит) не надо, я не полиплот. |
Liora |
(-Ъ- @ 02.02.2017 15:28) HRM это не зонд - High-resolution melting analysis - ПЦР метод для обнаружения различий (полиморфизмов) в ДНК. Честно, устал вытягивать из Вас инфо. Нужны сиквенсы праймеров и протокол хотя бы краткий над чем Вы работаете. Можете выкладывать на инглиш, на идиш (иврит) не надо, я не полиплот. А можно ваш мейл? Написала бы в нормальном формате. Тяжело искать по памяти русские буквы. И спасибо вам огромное за желание помочь. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Liora @ 02.02.2017 17:20) А можно ваш мейл? Написала бы в нормальном формате. Тяжело искать по памяти русские буквы. И спасибо вам огромное за желание помочь. Отправил.
|
Sardanapal |
(Liora @ 01.02.2017 12:46) 1. Убедиться в том, что исходный материал содержит кровь человека можно с помощью иммунохроматографических тестов 2. Добиться всегда чистых контролей при амплификации мтДНК на 35 циклах в обычной лаборатории практически невозможно. Это соответствует примерно 0.1 pg геномной ДНК выделенной из крови (т.е. 1/65 генома одной клетки). Для этого нужны "чистые помещения". Но скорее всего для Вашей работы в этом нет необходимости. "Позитивные" на кровь человека комары будут выходить значительно раньше. Какой объем человеческой крови Вы ожидаете в комаре? Какой требуется уровень детекции? 1 мкл крови содержит 30-60 нг ДНК. Если выставите cut off на 32 циклах, вы достоверно будете выявлять 1 nl крови.
|
Liora |
(Sardanapal @ 04.02.2017 13:22) 1. Убедиться в том, что исходный материал содержит кровь человека можно с помощью иммунохроматографических тестов 2. Добиться всегда чистых контролей при амплификации мтДНК на 35 циклах в обычной лаборатории практически невозможно. Это соответствует примерно 0.1 pg геномной ДНК выделенной из крови (т.е. 1/65 генома одной клетки). Для этого нужны "чистые помещения". Но скорее всего для Вашей работы в этом нет необходимости. "Позитивные" на кровь человека комары будут выходить значительно раньше. Какой объем человеческой крови Вы ожидаете в комаре? Какой требуется уровень детекции? 1 мкл крови содержит 30-60 нг ДНК. Если выставите cut off на 32 циклах, вы достоверно будете выявлять 1 nl крови. Огромное спасибо вам за совет, я тоже предполагаю,что "позитивные" на кровь человека комары должны выхотить на более ранних сайтах, с сожалению в данный момент нет возможности удостоверится. Я тоже думала о том, чтобы укоротить циличность пцр, но это очень уж просто. Мы не ищем простых путей / На самом деле есть образцы, которые поднимаются только на круге 34-35, хоть и не много таких. |
Liora |
(Sardanapal @ 04.02.2017 13:22) 1. Убедиться в том, что исходный материал содержит кровь человека можно с помощью иммунохроматографических тестов Скажите пожалуйста, может вы знаете о RSID-Blood подобной системе, только для проверки 96 образцов одновременно? |
Sardanapal |
Но можно просто раститровать 1 мкл свежей крови и поставить амплификацию в повторах. Тогда вам будет понятно, где заканчивается чувствительность Вашего метода и начинается контаминация.
|
borigv Постоянный участник г. Саратов |
|
Liora |
(borigv @ 06.02.2017 07:11) У меня возник вопрос к ТС не совсем относящийся к вопросу темы: кровь в москитах переваривается со всеми компонентами - имеется ли зависимость количества ДНК человека детектируемой Вами от степени "переваривания обеда"? Например как функция от времени "после обеда"? Мне просто любопытно. Я понимаю что Вы не отсчитывали с секундомером и не проводили опросов среди отловленных комаров, но на Ваше ощущение как? В точности не смогу ответить, но "обед" 2-3 летней давности точно поддается определению, при условии, что условия хранения были правильными |
Liora |
(Sardanapal @ 05.02.2017 22:55) Но можно просто раститровать 1 мкл свежей крови и поставить амплификацию в повторах. Тогда вам будет понятно, где заканчивается чувствительность Вашего метода и начинается контаминация. "Раститровать" - это разные объемы брать? Правильно я понимаю? Очень хорошая идея! Но как я пойму, что идет уже контаминация, а не реально позитивный результат? В эксперименте с пустой платой получила несколько положительных результатов. |
Panaev Постоянный участник |
(Liora @ 06.02.2017 10:32) "Раститровать" - это разные объемы брать? Правильно я понимаю? Очень хорошая идея! Но как я пойму, что идет уже контаминация, а не реально позитивный результат? В эксперименте с пустой платой получила несколько положительных результатов. Раститровать - это сделать последовательные разведения образца.
|
borigv Постоянный участник г. Саратов |
|
Liora |
(borigv @ 08.02.2017 08:23) Уважаемая ТС не совсем поняла мой вопрос: меня интересовало не время сохранности ДНК в "зафиксированном" образце - об этом я имею некоторое представление. Меня интересовало сохранность ДНК при переваривании крови живым москитом, во времени. В течении какого времени кровь переваривается москитом до такой степени что ДНК человека с помощью ПЦР не улавливается? Ваши образцы поступают к Вам каким образом - отлов в "дикой природе" с неизвестным временем после "обеда"? Или "кормление" москитов в лаборатории? Извините за неточный ответ. Менее недели и от крови нет и следа, уже формируются яйца. По этой причине в моих тестах участвуют только 100% положительные на наличие крови особи.
|
Liora |
(ksm @ 07.02.2017 21:50) "Но как я пойму, что идет уже контаминация, а не реально позитивный результат?" например, если под подозрением ваш 10-кратный ПЦР буфер, то вы его грубо говоря используете вместо матрицы. т.е. все пробы ставите как отрицательные контроли. достаете баночку, гарантированно не контаминированную с новым буфером, делаете смеси 1/9, 1/99, 1/999 (подозреваемый/новый). вносите в ПЦР как ни в чем не бывало... и дальше, если у вас Cq будет возрастать при разведении, то это оно. теоретически, придется прогнать все реактивы. практически же серийные разбавления не нужны, а достаточно по очереди исключить все. пипетки тоже, кстати пакет с пробирками тоже, кстати еще я бы попросил на вашем месте еще кого-нибудь сделать все действия ровно как вы, а потом сравнить... ...и в другой лабе... и так далее, пока юная мисс Марпл не исключит назойливого вредителя! ...в общем, мы всем форумом очень болеем за вас, не забывайте держать нас в курсе ваших похождений. не забывайте добавлять фотографии к вашим постам! Ооооох. Буфер каждый раз новая пробирка открыавется, праймеры свежие сделала, вода, пробирки, платы и пипетки проходят очистку и УФ. Другие руки тоже делали - было намного хуже. Насчет делаьь в другой лаборатории, с этим очень сложно, пытаюсь и этого добиться. Пока пытаюсь играться с условиями ПЦР, но буду рада новым идеям, т.к. мои на исходе |
Liora |
(ksm @ 08.02.2017 14:56) Писала выше - Работаю , как в операционной, 2 пары перчаток, халат, первая пара перчаток обрабатывается хлоркой. Все коробочки, стенды, пробирки обрабатываютя хлоркой и проходять 20 мин УФ. Но все равно получаю контаминацию |
Liora |
|
vb Постоянный участник |
(Liora @ 08.02.2017 14:03) Писала выше - Работаю , как в операционной, 2 пары перчаток, халат, первая пара перчаток обрабатывается хлоркой. Все коробочки, стенды, пробирки обрабатываютя хлоркой и проходять 20 мин УФ. Но все равно получаю контаминацию Вопервых не верю, что хлоркой. Гипохлорид кальция нынче непопулярен както. вовторых, толку от нее никакого, если просто протереть перчатки, как и от уф. |
vb Постоянный участник |
(ksm @ 08.02.2017 23:06) "вовторых, толку от нее никакого," - неправда ваша! а как же душевное спокойствие и самоуверенность?! Так если б было. Нет спокойствия, сами видите.
|
vb Постоянный участник |
(ksm @ 08.02.2017 23:06) "вовторых, толку от нее никакого," - неправда ваша! а как же душевное спокойствие и самоуверенность?! "Гипохлорид кальция " - он Натрия. Белизна - натриевая соль В мое время под хлоркой понималось кальция |
Liora |
(ksm @ 08.02.2017 20:07) Да, одеваю 2 пары перчаток, одни на другие. Первые еще и очищаю хлоркой |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |