Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Unspecific RNase with low activity -- and low cytotoxity --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Yulia S
Постоянный участник
MA



 прочитанное сообщение 04.07.2006 10:53     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Уважаемое сообсчество.
Хочу обработать клетки РНКазои, так чтоб она не сэла всю клеточную РНК, а слегка подгрызла, и клетки еще после этого жили хотя бы часиков 12.
Сусчествует ли в природе такая РНКаза с маленькой кататлитической активностю? Или может есть такие мутации в РНКазе А или Т1, уменшаюсчие активность?
В пубмеде и Гоогле не нашла, там статйи болше по РНКазам с наоборот, высокой цитохичностю.
Пожалуйста, если кто-то что-то слышал про такие РНКазы или видел, откликнитесь.
Клетки 293Т, хотя впрочем на обэкте не зацикливаюсь. Обрабатывать собираюсь или путем трансфекции и експрессии, или же путем пермеабилизации и помесчения в раствор с РНКазой.
Участник оффлайн! AVP
Постоянный участник
New Jersey



 прочитанное сообщение 04.07.2006 11:55     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

(Yulia S @ 04.07.2006 03:53)
Ссылка на исходное сообщение  Уважаемое сообсчество.
Хочу обработать клетки РНКазои, так чтоб она не сэла всю клеточную РНК, а слегка подгрызла, и  клетки еще после этого жили хотя бы часиков 12.
Сусчествует ли в природе такая РНКаза с маленькой кататлитической активностю? Или может есть такие мутации в РНКазе А или Т1, уменшаюсчие активность?
В пубмеде и Гоогле не нашла, там статйи болше по РНКазам с наоборот, высокой цитохичностю.
Пожалуйста, если кто-то что-то слышал про такие РНКазы или видел, откликнитесь.
Клетки 293Т, хотя впрочем на обэкте не зацикливаюсь. Обрабатывать собираюсь или путем трансфекции и експрессии, или же путем пермеабилизации и помесчения в раствор с РНКазой.


что неужели в пубмеде и Гоогле не смогли найти????? не буду заниматься плагиатом известного классика говоря ....
посмотрите работы по RNases в которых проводили различные аминокислотные замены и какие к чему приводят... дальше и т.д.
да по некоторым правилам журналов у авторов можно совершенно свободно запрашивать опубликованные "материалы" в данном журнале....

по RNase T1 (for example)
Eur J Biochem. 1988 Apr 15;173(2):389-94.
Increase in nucleolytic activity of ribonuclease T1 by substitution of tryptophan 45 for tyrosine 45.
Nishikawa S, Morioka H, Kimura T, Ueda Y, Tanaka T, Uesugi S, Hakoshima T, Tomita K, Ohtsuka E, Ikehara M.
Faculty of Pharmaceutical Sciences, Osaka University, Japan.
The preparation and analysis of a mutant ribonuclease (RNase) T1 which possesses higher nucleolytic activity than the wild-type enzyme are described. The gene for the mutant RNase T1 (Tyr45----Trp45), in which a single amino acid at the binding site of the guanine base has been changed, was constructed by the cassette mutangenesis method using a chemically synthesized gene [Ikehara, M. et al. (1986) Proc. Natl Acad. Sci. USA 83, 4695-4699]. In order to reduce the nucleolytic activity of the enzyme in vivo, this gene was expressed in Escherichia coli as a fused protein connected through methionine residues to other proteins at both the N- and C-termini. After liberation from the fused protein by cleavage with cyanogen bromide at the methionine junctions, the mutant RNase T1 was purified by column chromatography. The nucleolytic activity toward pGpC increased to 120% of that of wild-type RNase T1. The kinetic parameters of the mutant enzyme demonstrate that this higher nucleolytic activity is due to a higher affinity for the substrate, probably because of an increased stacking effect in the binding pocket for the guanine base. This mutant enzyme also possessed a higher nucleolytic activity against pApC than wild-type RNase T1.
etc.

по RNase A (for example)
Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Apr 12;91(8):2920-4.
Role of glutamine-117 in the ribonucleolytic activity of human angiogenin.
Center for Biochemical and Biophysical Sciences and Medicine, Harvard Medical School, Boston, MA 02115.
The crystal structure of human angiogenin (reported in the preceding paper in this issue) reveals that the site that corresponds to the pyrimidine binding site of RNase A is obstructed by Gln-117. Mutation of this residue to Ala and Gly is here found to increase activity 11- to 18-fold and 21- to 30-fold, respectively, toward dinucleotide, polynucleotide, and cyclic nucleotide substrates, but without changing specificity. The enhanced activity of Q117G toward CpA is due to a 5-fold decrease in Km and a 6-fold increase in kcat. Its Ki value for 2'-CMP is 5-fold lower than that of native angiogenin, whereas its Ki value for 5'-AMP is unchanged. It has been reported previously that mutating Asp-116 to Ala increases activity 15-fold. The double mutant D116A/Q117A is shown to be only slightly more active than each individual mutant. The present results demonstrate that Gln-117 impedes the ribonucleolytic activity of angiogenin, as predicted by x-ray crystallography. Moreover, they suggest that prior to or during catalysis angiogenin must undergo a conformational change to reorient the C-terminal segment that contains this residue, and that a similar reorganization is required for the mutants as well. This view is supported by molecular modeling of an angiogenin-uridine vanadate complex. These in vitro findings have implications for the angiogenic activity of angiogenin in vivo.
etc.

Сообщение было отредактировано AVP - 04.07.2006 11:56
Участник оффлайн! Yulia S
Постоянный участник
MA



 прочитанное сообщение 04.07.2006 12:50     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

(AVP @ 04.07.2006 09:55)
Ссылка на исходное сообщение  что неужели в пубмеде и Гоогле  не смогли найти????? не буду заниматься плагиатом известного классика говоря ....
посмотрите работы по РНасес в которых проводили различные аминокислотные замены и какие к чему приводят... дальше и т.д.
да по некоторым правилам журналов у авторов можно совершенно свободно запрашивать опубликованные "материалы" в данном журнале....



Dear AVP!
Спасибо за отклик!
Но!!!
Приведенные ссылки, и похойие работы я-то как раз нашла.
Но там описываются мутации УВЕЛИЧИВАЮЩИЕ РНказную активность.
А мне надо УМЕНьШАЮЩИЕ.
Работ направленных на увеичение РНКазной активности а так же цытотоксичности много, ибо такие РНКазы в составе конюгатов с опухлеспецифичными антителами применяются в противоопухлевой терапии.
А вот мутаций, уменьшающих активность (но не совсем елиминирующих ее) я не нашла.
Буду благодарна, если кто-нибудь предметно укажет мне, что я в этом не права.
Юля.
Участник оффлайн! Vladimir70
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 04.07.2006 13:00     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Берете РНКазу А , отрезаете первыэ 15 аминокислот и получаете РНКазу S, которая активностью не обладает пока вы отдельно не добавите этот пептид в реакцию.

Novagen

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Yulia S
Участник оффлайн! Yulia S
Постоянный участник
MA



 прочитанное сообщение 04.07.2006 13:38     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

то Владимир.
Пасиба. Ща посмотрим
Участник оффлайн! AVP
Постоянный участник
New Jersey



 прочитанное сообщение 04.07.2006 13:59     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

(Yulia S @ 04.07.2006 05:50)
Ссылка на исходное сообщение
Но!!!
Приведенные ссылки, и похойие работы я-то как раз нашла.
Но там описываются мутации УВЕЛИЧИВАЮЩИЕ РНказную активность.
А мне надо УМЕНьШАЮЩИЕ.
Работ направленных на увеичение РНКазной активности а так же цытотоксичности много, ибо такие РНКазы в составе конюгатов с опухлеспецифичными антителами применяются в противоопухлевой терапии.
А вот мутаций, уменьшающих активность (но не совсем елиминирующих ее) я не нашла.
Буду благодарна, если кто-нибудь предметно укажет мне, что я в этом не права.
Юля.


и что что совсем нету?????
J Biol Chem. 1989 Jul 15;264(20):11621-5.
Conformational stability and activity of ribonuclease T1 and mutants. Gln25----Lys, Glu58----Ala, and the double mutant.
Shirley BA, Stanssens P, Steyaert J, Pace CN.
Biochemistry Department, Texas A & M University, College Station 77843.
Ribonuclease T1 (RNase T1) and mutants Gln25----Lys, Glu58----Ala, and the double mutant were prepared from a chemically synthesized gene, cloned and expressed in Escherichia coli. The wild-type RNase T1 prepared from the cloned gene was identical in every functional and physical property examined to RNase T1 prepared from Aspergillus oryzae. Urea and thermal unfolding experiments show that Gln25----Lys is 0.9 kcal/mol more stable and Glu58----Ala is 0.8 kcal/mol less stable than wild-type RNase T1. In the double mutant, these contributions cancel and the stability does not differ significantly from that of wild-type RNase T1. For the double mutant, the dependence of delta G on urea concentration is significantly greater than for wild-type RNase T1 or the single mutants. This suggests that the double mutant unfolds more completely in urea than the other proteins. The activity of Gln25----Lys is identical with that of wild-type RNase T1. The activities of Glu58----Ala and the double mutant are 7% of wild-type when GpC hydrolysis is measured (due to a 35-fold decrease in kcat), and 37% of wild-type when RNA hydrolysis is measured. Thus, Glu58 is important, but not essential to the activity of RNase T1.
Участник оффлайн! AVP
Постоянный участник
New Jersey



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  04.07.2006 14:12     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

Protein Sci. 2002 Jan;11(1):72-81.
Conformational strictness required for maximum activity and stability of bovine pancreatic ribonuclease A as revealed by crystallographic study of three Phe120 mutants at 1.4 A resolution.
Chatani E, Hayashi R, Moriyama H, Ueki T.
Division of Applied Life Sciences, Graduate School of Agriculture, Kyoto University, Sakyo, Kyoto 606-8502, Japan.
The replacement of Phe120 with other hydrophobic residues causes a decrease in the activity and thermal stability in ribonuclease A (RNase A). To explain this, the crystal structures of wild-type RNase A and three mutants--F120A, F120G, and F120W--were analyzed up to a 1.4 A resolution. Although the overall backbone structures of all mutant samples were nearly the same as that of wild-type RNase A, except for the C-terminal region of F120G with a high B-factor, two local conformational changes were observed at His119 in the mutants. First, His119 of the wild-type and F120W RNase A adopted an A position, whereas those of F120A and F120G adopted a B position, but the static crystallographic position did not reflect either the efficiency of transphosphorylation or the hydrolysis reaction. Second, His119 imidazole rings of all mutant enzymes were deviated from that of wild-type RNase A, and those of F120W and F120G appeared to be "inside out" compared with that of wild-type RNase A. Only approximately 1 A change in the distance between N(epsilon2) of His12 and N(delta1) of His119 causes a drastic decrease in k(cat), indicating that the active site requires the strict positioning of the catalytic residues. A good correlation between the change in total accessible surface area of the pockets on the surface of the mutant enzymes and enthalpy change in their thermal denaturation also indicates that the effects caused by the replacements are not localized but extend to remote regions of the protein molecule.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Yulia S

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 06.12.19 12:06
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft