Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Белковый электрофорез - образцы
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
TXY
IP-штамп: frGqyYT8IU7LU
гость



 прочитанное сообщение 22.06.2005 11:06     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Помогите, плиз!
На гель наношу белковые образцы после осаждения ТХУ. Но, при разделении, образцы расползаются очень сильно вширь. Что делать? Неужели остатки ТХУ так сильно влияют?
Спасибо огромное!
Guest
IP-штамп: frWKf2AKRVu2Q
гость



 прочитанное сообщение 22.06.2005 11:21     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

После ТХУ нужно ц.ф. (собрать белок), промыть образцы bidist (холодным) раза 3 (осторожно не вылить осадок!!!), а затем растворить в sample solution 1,5x и на форез.
Остатки ТХУ действительно не желательны, но расползание происходит не из-за кислоты. Проверьте протокол фореза со стандартным.
При нанесении белка в карман он хорошо садится на его дно или нет??? Модет быть еще проблема в ионной силе: нужна низкая ион. сила. Повышенная конц ионов (особенно Ca) приводит к таким проблемам!!!!
А что др белки на форезе так же себя ведут?
TXY
IP-штамп: frGqyYT8IU7LU
гость



 прочитанное сообщение 22.06.2005 11:29     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Проблема не в форезе, это точно.
Образцы содятся в лунку хорошо, но при наложении тока - начинают расползаться. Другие образцы (без осаждения) хорошо бегут на том же геле. Видимо, остатки ТХУfrown.gif
Да, а после промывки бидистиллятом, надо крутить или нет, а не потеряются ли белки, которые могут раствориться в воде?
Спасибо!
Участник оффлайн! Oleg Klychnikov
Постоянный участник
Moscow/Amsterdam->Leiden



 прочитанное сообщение 22.06.2005 11:31     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

как отмываетесь от ТХУ? не желтеет ли буфер для образца?
Guest
IP-штамп: frGqyYT8IU7LU
гость



 прочитанное сообщение 22.06.2005 11:45     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Образцы просто осаждаются ДОХ + ТХУ. После образцы крутятся, супер удаляю пипеткой, а осадок растворяю в Леммли буфере (буфер желтеет, но добаляю капельку аммиака) и на форез.
TXY
IP-штамп: frGqyYT8IU7LU
гость



 прочитанное сообщение 22.06.2005 11:47     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Извиняюсь, предыдущее сообщение мое под ником Guest:)
Участник оффлайн! Oleg Klychnikov
Постоянный участник
Moscow/Amsterdam->Leiden



 прочитанное сообщение 22.06.2005 11:53     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

скорее всего, у Вас полно дезоксихолата, попробуйте
помыть раза 2-а холодным 80% ацетоном, с добавление
немного гидроксида аммония - так, чтобы просто рН поднять
(примерно 2-3 мкл на 15 мл)
TXY
IP-штамп: frGqyYT8IU7LU
гость



 прочитанное сообщение 22.06.2005 12:01     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

Спасибо, попробую!
Участник оффлайн! Baudelaire
Постоянный участник
где только можно



 прочитанное сообщение 22.06.2005 14:06     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

Помыть осадок спиртом 70%, растворить в сампл-буфере. и нанести.
Даже если будет желтым ничего страшного. При прохождении через гель всё будет нормально.
Guest
IP-штамп: frQtbDwjgPMwo
гость



 прочитанное сообщение 22.06.2005 14:14     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

У меня дезоксихолат в 70% спирте растворился. А у Вас нет?
Участник оффлайн! Oleg Klychnikov
Постоянный участник
Moscow/Amsterdam->Leiden



 прочитанное сообщение 22.06.2005 14:26     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

можно и в спирте, рояли не играет, лучше немного и его защелочить,
потом хорошо высушить от спитра - т.к. это немного портит картинку
фореза
(на спидваке минут 20, или на -20 просто в открытых эппендорфах
на ночь)
Участник оффлайн! Baudelaire
Постоянный участник
где только можно



 прочитанное сообщение 22.06.2005 14:40     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

(Oleg Klychnikov @ 22.06.2005 12:26)
Ссылка на исходное сообщение  можно и в спирте, рояли не играет, лучше немного и его защелочить,
потом хорошо высушить от спитра - т.к. это немного портит картинку
фореза
(на спидваке минут 20, или на -20 просто в открытых эппендорфах
на ночь)


Согласен Олег
Участник оффлайн! Mac-1
Постоянный участник
оттуда



 прочитанное сообщение 22.06.2005 19:37     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

Методов осаждения трихлорацетатом образцов для Э/Ф существует масса, у каждого свой собственный.

Попробуйте осаждать просто до 10% ТХУ без ДОХ, и промывать осадок 2 раза 1 мл (если осждали в 1.5 мл пробирках) смесью ацетон + 0.1 N HCl, это помогает в 90% случаев.

Дело в том, что ТХУ модифицирует белок - связывается со свободными аминогруппами белка, например в остатках лизина или аргинина. И искажение зон (расширение) происходит за счет высокой ионной силы этого самого ранее связанного ТХУ.

Этот метод, чтобы убрать связанный ТХУ, основан на классической схеме очистки синтетических пептидов: после синтеза любой пептид содержит некоторое количество связанного ТФУ в зависимости от числа свободных аминогрупп, что сильно влияет на общий МВ пептида - может увеличить его почти в 2 раза (плюс заметно закисляет раствор при растворении). Вообще-то, есть специальные программы, которые рассчитывают МВ пептидов с учетом связанного ТФУ (в частности такая функция есть у большинства программ для синтеза пептидов), однако проще всего этот связанный ТФУ удалить: после лиофилизации растворить пептид опять в любой разбавленной летучей кислоте (солянка, уксусная), которая вытеснит ТФУ, а затем повторно лиофилизовать, при этом удаляется как сама ТФУ, так и замещающая ее кислота.
По сходному методу работает Пирсовский кит для очистки и концентрации образцов для СДС э/ф.

Если вы используете ДОХ для повышения выхода вашего белка при осаждении, то гораздо лучше добавлять в его раствор перед осаждением carrier protein примерно 0.1 - 1 мг/мл, я обычно добавляю инсулин или РНКазу (но можно и обычный БСА), выход при этом больше, чем с ДОХ. Также, если образец не настолько разбавлен и вы не хотите перегружать гель ведущим белком, то можете попробовать осаждать смесью ТХУ в ацетоне (с последующей промывкой ацетоном) - это намного эффективнее, чем осаждение только ТХУ с последующей промывкой ацетоном.
А если хотите информации побольше - то загляните сюда: http://www.ls.huji.ac.il/~purification/Pro...cipitation.html

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): AnKri
Участник оффлайн! Nuken
Участник



 прочитанное сообщение 02.08.2005 09:41     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

Помнится я делал так: после осаждения промывал спиртом (70%)+Tris-HCl, pH=8 - 8,5 для нейтрализации ТХУ, потом ацетоном и наконец эфиром. Белок получался беленьким, ну иногда чуть сероватым... Растворялся в сэмпл буфере отлично.
ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 02.08.2005 14:57     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

Мое мнение: просто вы нейтрализуете ТХУ, у вас образуется соль аммония, вот она то вам и гадит форез. Отмывать ТХУ от образцов лучше всего спирт-эфиром 1:1 или ацетон-эфиром 1:1.
Участник оффлайн! Afalina
Участник



 прочитанное сообщение 16.08.2005 12:20     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

да, дело в аммиаке.
если хорошо отмыть этанолом от ТХУ (чтобы буфер был синим) или гнать просто желтенькие образцы (не знаю, правда, как они у вас перенесут такое кипячение), то все идет нормально.
Участник оффлайн! metrim
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 05.03.2018 23:14     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

А какие шансы получить после осаждения с ТХУ активные ферменты?
Речь об экзоферментах гидролазах, которые микробы выделяют в культуральную среду.
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 06.03.2018 01:06     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

Не большие, но например пепсин и рибонуклеаза может и выживут. Чем меньше мол. масса белка, чем легче он ренатурирует из разных денатурированных состояний, тем больше шансов.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): metrim
Участник оффлайн! metrim
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 07.03.2018 12:04     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

Не совсем по теме, но малость в продолжение: мне нужно сделать зимограмму в геле, т.е. должна будет идти ерментативная реакция белков "засевших" в геле. Сейчас у меня на реакцию отвведено 2 часа, но хотел бы удлинить и оставлять на ночь, только наверное за это время белкииз геля то вымоются, ну или как минимум полосы адски дифундируют.
Какими способами можно снизить диффузию-растворимость белков, не заингибировав при этом их активность? в принципе пусть активность даже вдаое упадет, но хоть какая то сохранится...
Субстрат для реакции у меня включен сразу в состав геля. Ферментативные реакции должны будут проводится при рН от 4 до 8.5.
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.03.2018 10:18     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

Попробуйте добавить в гель какой - нибудь ПЭГ 400(это жидкий ПЭГ) и глицерин по 2%.
Участник оффлайн! Tom1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 09.03.2018 16:18     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

Глицерин можно и до 5%...
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  20.11.2021 18:09     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

http://www.authorstream.com/Replicawatches24/
https://about.me/Replicawatches24
https://moz.com/community/users/17050093
https://trello.com/rolexrelicawatches/activity
https://replicarolexwatches.dreamwidth.org/365.html
https://visual.ly/users/watcheshutuk/portfolio
https://www.viki.com/users/watcheshutuk_549/about
https://www.academia.edu/s/14bdb7d4fe?source=link
https://www.slideshare.net/Nowseore/guide-o...ex-watch-online
https://audiomack.com/rolexrelicawatches
https://soundcloud.com/replicarolexwatches
https://www.bagtheweb.com/u/fakerolexwatches/profile
https://www.flipsnack.com/ReplicawatchesUK/...ca-watches.html
https://www.4shared.com/office/zA4L7Rmzea/G...hase_a_Fak.html?
https://codepen.io/Rolexrelicawatches/full/abBEzaQ
Участник оффлайн! watchesonline89
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  26.12.2022 11:32     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #23 множественное цитирование

https://telegra.ph/Advantages-Of-Replica-Watches-08-03
https://issuu.com/home/published/_6_.docx
https://www.gta5-mods.com/paintjobs/watchesswiss
https://omegawatches89.onweb.it/
https://padlet.com/omegawatches89/je3eq9ol3xzmb9bp
https://www.pinterest.com/omegawatches89/
https://knowyourmeme.com/users/omegawatches89
https://bitcointalk.org/index.php?topic=76487.new#new
https://omegawatches89.blog.hu/
https://knowyourmeme.com/forums/general/top...f-so-why?page=1
https://penzu.com/p/c6f21f5d
https://www.reddit.com/user/omegawatches89/...are_so_popular/
https://www.vingle.net/posts/4647076
https://penzu.com/p/c68b65cc
https://diigo.com/0pige9

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 28.03.24 17:41
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft