Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
solo IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
А то сегодня с оседи попробовали - одни клетки после инкубации, а ткань кудато исчезла? Они ко мне, а я к Вам. Solo. |
Alex IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
принципы: 1. ВАРИТЬ - смотря что - как правило паренхиматозные органы, а варится соединительная ткань (коллаген) между клетками, поэтому клетки отваливаются смотря чем - коллагеназы как известно бывают разные - разных типов A-D, разных производителей, из разных источников (чаще всего из клостридий) как - если невозможно перфузировать орган раствором коллагеназы через сосудистое русло по причинам: малых размеров органа и сосудов, отсутствия микроскопической техники, недостаточно зрелой ткани (например эмбриона), лени..., то орган механически измельчают (ножницы, скальпель) в растворах, "не поддерживающих межклеточные контакты" - без Ca и Mg , ЭДТА... (EBSS, HBSS-CMF, PBS, среда). далее кусочки ткани помещаются в раствор коллагеназы (концентрации разные......), условия: - +37С (инкубатор) - на шейкере - наличие Ca++ и отсутствие сыворотки в среде (растворе) коллагенизации - время - в зависимости от концентрации (5-30 мин). - кратность 1-2 раза (если 2, то отмывка обязательна) ---------------------------------------- 2. НЕ ПЕРЕВАРИТЬ! остановить действие коллагеназы, а то сваришь не только коллаген, но и все свои клетки методы: - +4C (холод) - сыворотка - разбавление (отмывка) - ЭДТА ну вот только 2 принципа, остальное тонкости - какой орган, какие цели и задачи, какая коллагеназа и т.д. |
picarus IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
1. В средах без кальция тоже работает, видимо, для активности фермента достаточно следов, которые имеются в самой ткани 2. заблуждение, что коллагеназу может инактивировать сыворотка. Это Alex малость попутал с трипсином. Сыворотка может только замедлить действие - "отвлекает" активность фермента на сывороточные белки. В отличие от свиного трипсина, коллагеназу получают из бактерий - им сывороточные белки пофиг |
picarus IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
Клетки коллагеназа не жалеет, так что лучше недоварить. |
solo IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
(Перед этим не туда отправил ответ Алексу -после вчерашнего начала отмечания Дня Независимости США) |
picarus IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
|
Alex IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
и без Ca++ будет работать, но чуть хуже с сывороткой -да, не ингибирует, но опять снижает активность... вообще специфических ингибиторов коллагеназы не знаю (это с трипсином всё ясно)... кто-нибудь объяснит роль ЭДТА с снижении активности коллагеназы? А то есть ряд протоколов, причём при RT пойду книжку почитаю |
Alex IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
• Tissue is minced with a sterile scalpel or scissors. • Wash the tissue several times in HBSS. • The tissue fragments are soaked at +37°C. Increased efficiency is obtained using a rocker platform and supplementing the digest with 3 mM CaCl2. Organ perfusion: • Digest is prewarmed to +37°C and perfused at a rate preoptimized for the particular organ. Addition of 3 mM CaCl2 increases the efficiency of dissociation. • Dispersed cells and tissue fragments are separated from larger pieces by passing the mixture through a sterile stainless steel or nylon mesh. Fresh collagenase solution can be added to the fragments if further disaggregation is required. • Wash several times to eliminate debris and enzyme solution. A density separation step (Nycodenz) will give a cleaner suspension. • Resuspend the pellet in the culture medium and incubate under predetermined conditions. Copyright: Invitrogen Corporation www.invitrogen.com ------ to Solo: a что варим та? |
solo IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
Ну что они могут варить - склеру кроличью! Коллагеновывй мешок. А кролика жрут - потушат под белым вином с изюмом и черносливом и хавают! Представляешь?! А шефу говорят - его всего коллагеназа растворила, капнула на него случайно и растворила! |
AleksSH |
Если есть что почитать по работе с коллагеназой - скиньте плииз. |
« Предыдущая тема · Клеточные технологии · Следующая тема » |