molbiol.ru -> Определение концентрации белка (Брэдфорд; Лоури)

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Определение концентрации белка (Брэдфорд; Лоури) -- deleted by avor --

Тема связана с: Методы Мерион Брэдфорд и Лоури
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

страницы (4): < 1 2 3 4 >

v.sheva

13.04.2011 13:03

URL #101

Скажите влияет ли рН исследуемого раствора при определении белка по Лоури?

ajadan

27.09.2011 14:08

URL #102

"...А претензий к методу на 280 не меньше чем к методу на 200. Им пользуются для чистых белков в основном. Для смесей так белок никто не измеряет."

Абсолютно не верно!

как раз концентрацию белка в смеси не разделенных белков лучше (точнее и быстрее) измерять на 280 ( или Кристианом Варбургом 260/280), я бы даже сказал не лучше а правильнее. (исклучения - белки без триптофана, коих довольно мало, а в смесях можно сказать нет), ели вы хоть чтото знаете о своем белке, и способны найти экстинкцию для похожих - это самый простой и точный вариант, даже если вы ничего не знаете ошибиться больше чем в 2 раза практически невозможно. (для смесей белков ошибка еще меньше)
измерения на 205 самые точные, но требуют хорошего оборудования и рук (и качественной пробоподготовки). сходу чачу им измерять конечно же нельзя. (в этой области поглощает почти все, за исключением воды, сульфатов, хуже фосыфаты, галогениды, про органику вообще молчу)
все методы с краской МЕНЕЕ точны чем предыдущие, хотя иногда и чувствительнее. И придуманы были для измерения белков в растворах с большим количеством маскирующих (поглощающих на 280 небелковых компонентов). так ошибка в 2 раза считается очень хорошим результатом

, по бредфорду, при измерении "неизвестного" белка и калибровке по БСА, ошибка 5-10 раз частое явление. (БСА вообще не рекомендуют использовать в качестве стандарта из-за его очень высокого сродства к кумаси, впрочем это относится и к овльбумину). если у вас нет стандарта белка относящегосяк тому же семейству что и ваш исследуемый, то красками пользоваться можно только в крайнем случае если никак нельзя достоверно измерять прямым поглощением в уф.

Guest
IP-штамп: frGqyYT8IU7LU
гость

14.01.2013 12:47

URL #103

Коллеги, подскажите пожалуйста, будут ли работать Брэдфорд, Лоури, BCA, если белки разведены в р-ре 6М гуанидингидрохлорида с 2М HCl? Спасибо.

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

14.01.2013 13:59

URL #104

А вы проверте. скорее всего нет.

Guest
IP-штамп: frb4J7h6RI.aI
гость

14.01.2013 16:51

URL #105

Если не найдутся те, кто уже проверял - возможно, попробую. Но тоже думаю, что не будут работать. Из-за соляной к-ты. Спасибо.

Агроном
Постоянный участник

16.01.2013 14:31

URL #106

будут ли работать Брэдфорд, Лоури, BCA

А может и сработает Лоури - так как белок там предварительно осаждается из раствора с помощью ТХУ. Поясните - что вы подразумеваете под абброй "ВСА"? Альбумин б(в)ычий что-ли?

Сообщение было отредактировано Агроном - 16.01.2013 14:33

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

16.01.2013 21:00

URL #107

--А может и сработает Лоури - так как белок там предварительно осаждается из раствора с помощью ТХУ.

Хотел бы я видеть как ТХУК высаживает белки из 6М гуанидинийхлорида с 2М HCl

--Поясните - что вы подразумеваете под абброй "ВСА"? Альбумин б(в)ычий что-ли?
http://molbiol.ru/protocol/17_07.html

Поблагодарили (1): Агроном

rafflesia

26.09.2014 18:59

URL #108

Коллеги, скажите, будет ли метод Лоури правильно определять концентрацию белка, если в буфере есть аргинин? или аргинин все-таки исказит результат?

guest: ммм
IP-штамп: frQlBxj4iQSg.
гость

27.09.2014 06:59

URL #109

Не должен он мешать, по идее.

guest: ммм
IP-штамп: frQlBxj4iQSg.
гость

27.09.2014 07:02

URL #110

Неужели нельзя просто проверить: сравнить как реагирует Лоури на воду(буфер) и на раствор аргинина.

metrim
Постоянный участник
Москва

19.03.2016 01:30

URL #111

Готовил реактив для Брэдфорда больше года назад.
Сейчас обратил внимание что на просвет в банке - какая то взвесь
Вопрос: можно ли раствор регенерировать (докапать например фосворной кислоты, фильтрануть) или только в помойку ?
холостое определение (1:1 реактив : вода) - бесцветный раствор без признаков синевы

MMM
Постоянный участник

19.03.2016 06:58

URL #112

Можете фильтрануть и сделать новую градуировку. Она может быть нехорошей. Скорее всего очень пологой, низкий коэффициент отклика. Если это так, придется все переделать. Что бы Брэдфорд долго стоял надо использовать при приготовлении краситель наилучшего качества и фосфорную кислоту тоже, DI - воду и хранить на +4^оС.

Керуак

23.04.2016 21:21

URL #113

После ИОХ с двумя буферами (фосфатный, pH 5,3 и трис-HCl 9) мерил концентрацию по Лоури, а во фракциях минуты через две после добавления Фолина получается какая-то муть, будто капнули белой гуаши в синюю воду :< Причём в тех пробирках, которые после вымывания белков после смены буфера, так там всё нормально, мути нет. Ионообменник - ДЭАЕ целлюлоза, пропускали концентрированный медок после фильтрации через мембрану на 10 кДА. Что может давать муть?

MMM
Постоянный участник

23.04.2016 22:10

URL #114

Приведите исчерпывающий состав буферов, использованных для хроматографии и исходного буфера в котором был белок.

Керуак

24.04.2016 09:06

URL #115

Белок был без буфера, просто в дистиллировке; фосфатный - 0,2 М, KH2PO4, pH 5,3, доводил NaOH, Трис-HCl, собственно, трис (тоже 0,2 М), доводил солянкой, pH 9

Сообщение было отредактировано Керуак - 24.04.2016 09:07

MMM
Постоянный участник

24.04.2016 09:15

URL #116

A осадок образуется только с фосфатным буфером? попробуйте без белка пустой буфер померить. Есть предположение по поводу фосфата.

Керуак

24.04.2016 09:39

URL #117

Ну, в общем, как получается. Я первый раз провёл хроматографию, как только забил колонку, промывал буфером (тоже фосфатным) с pH 7. Не подумал как-то, белки не закрепились и вышли вместе со всем. После ИОХ колонка осталась в трис-буфере. Через день промыл колонку фосфатным буфером с pH 5,3, уравновесил им, провёл хроматографию, сделал Лоури. В обоих случаях мутность была во всех фракциях, где что-то выходило, т.е. в первых фракциях до смены буфера и после смены буфера, когда выходили закрепившиеся белки, а вот уже где всё отмылось, там не было мути. Я теперь грешу на трис, потому что в книжке (Справочник биохимика Доусона) написано, что трис в числе прочих соединений мешает определению белка. Но тогда почему мутность только там, где выходило, а где ничего не вышло, там её нет?

(MMM @ 24.04.2016 10:15)

Попробую, конечно же.
Муть мутью, но я померил на ФЭКе с ней, вроде получается что-то... Пики есть
https://img-fotki.yandex.ru/get/45082/79581...7_45f43f86_orig

MMM
Постоянный участник

24.04.2016 11:02

URL #118

Возможно у вас очень высокая концентрация белка и он дает нарастворимый осадок с фосфовольфраматами. А про медно щелочной раствор в Лоури вы случайно не забыли?

Сообщение было отредактировано MMM - 24.04.2016 11:16

Керуак

24.04.2016 15:07

URL #119

В смысле медно-щелочной раствор?
По калибровке получается, что концентрация белка в вышедших после смены буфера фракциях примерно 16,69 мкг/мл

Сообщение было отредактировано Керуак - 24.04.2016 15:37

MMM
Постоянный участник

24.04.2016 19:34

URL #120

Перед Фолиным в методе Лоури белок выдерживается 10 минут в "щелочном" растворе медного купороса и только после этого в этот раствор добавляют Фолина.

Сообщение было отредактировано MMM - 24.04.2016 19:36

Керуак

24.04.2016 20:25

URL #121

Конечно не забыл

MMM
Постоянный участник

24.04.2016 21:37

URL #122

а каких нибудь твинов, тритонов, нонидетов в буферах не было?

Керуак

24.04.2016 21:56

URL #123

Определенно нет

Керуак

25.04.2016 15:11

URL #124

Попробовал Лоури сделать чисто с буферами, появилась муть в пробирке с фосфатным... Думаю, нормально ли будет заменить ацетатным? pH вроде подходит

MMM
Постоянный участник

25.04.2016 17:30

URL #125

Ну, вот, подтверждается первое предположение о том, что фосфат взаимодействует с фосфовольфраматами и фосфомолибдатами изменяет их стехиометрию и они становятся малорастворимыми.

---Думаю, нормально ли будет заменить ацетатным? pH вроде подходит
Я бы предпочел цитрат.

Сообщение было отредактировано MMM - 25.04.2016 17:31

Oceana777

30.09.2016 14:21

URL #126

Уважаемые коллеги! Помогите разобраться! Занимаюсь определением активности антиоксидантных ферментов. Их активность пересчитывается на мг белка. Белок определяю по Бредфорду. По какой формуле мне производить расчёт белка???
Заранее спасибо

MMM
Постоянный участник

30.09.2016 14:29

URL #127

По градуировочному графику, который строится на основании стандартных растворов белка(чаще всего бычьего сывороточного альбумина).

Сообщение было отредактировано MMM - 30.09.2016 14:30

Oceana777

30.09.2016 14:54

URL #128

Это сделала! Получила концентрацию белка (скажем 2320) по кривой. Перевела её в мг/мл (2,232). Потом посчитала по формуле = 2.232*3 (объем буфера, в котором растирала растения) / 0,3 (масса навески, г). В итоге получила содержание белка: 22,32 мг/г сырой ткани. Правильно ли это? или нужно ещё умножать на тот объем растит.вытяжки, которую добавляла к Бредфорду?

MMM
Постоянный участник

30.09.2016 15:36

URL #129

Не делайте копипастов из одного форума в другой. Вы что думаете что среди мол. биологов ясновидящих больше чем среди химиков. Таки я вас уверяю их примерно одинаково нет ни там, ни здесь. Давайте потрудитесь написать, что и как делали.

Oceana777

30.09.2016 15:57

URL #130

МММ - это Вы к чему? Вы написали: По градуировочному графику, который строится на основании стандартных растворов белка(чаще всего бычьего сывороточного альбумина). Я Вам ответила: Это сделала! И затем расписала ЧТО и КАК делала. Поэтому причём здесь потрудитесь написать что и как делала - не понимаю. Читайте внимательно

MMM
Постоянный участник

30.09.2016 16:13

URL #131

http://www.chemport.ru/forum/viewtopic.php...=915997#p915997

Oceana777

30.09.2016 16:33

URL #132

МММ и что? я не имею права задавать одни и те же вопросы на разных форумах?

MMM
Постоянный участник

30.09.2016 16:53

URL #133

Имеете! Но! В этих своих вопросах вы допускаете одни и те же недочеты никак не улучшая их. Мы бы с радостью вам помогли, но вы сами наступаете на горло собственной песне, тщательно скрывая от нас критически важную информацию, без которой любой ответ не имеет смысла.

Oceana777

03.10.2016 11:51

URL #134

(MMM @ 30.09.2016 17:53)

МММ, конкретно от Вас я ничего не скрываю, ибо ВЫ никаких вопросов мне ВООБЩЕ не задвали, так что о чём разговор вообще???лично от Вас я ничего не скрываю, ибо именно с Вами у нас диалога не сложилось

ksm
Постоянный участник

03.10.2016 21:03

URL #135

(Oceana777 @ 30.09.2016 15:54)

огласите, пожалуйста, оптическую плотность при этом (при 2320), и длину волны и что у Вас за прибор?

Сообщение было отредактировано ksm - 04.10.2016 04:28

Oceana777

04.10.2016 16:18

URL #136

(ksm @ 03.10.2016 22:03)

огласите, пожалуйста, оптическую плотность при этом (при 2320), и длину волны и что у Вас за прибор?

Оптическая плотность: примерно 1,0513
Длина волны: 595 нм
Прибор: СФ 2000, Россия

ksm
Постоянный участник

05.10.2016 01:58

URL #137

ну вы учтите, что в районе единицы по ОП градуировка уже нелинейно себя вести может. если у вас кривая до 2 ОП, то пожалуйста
(вообще ржачно: "примерно 1.0513")

Сообщение было отредактировано ksm - 05.10.2016 02:08

Oceana777

10.10.2016 15:36

URL #138

(ksm @ 05.10.2016 02:58)

ну вы учтите, что в районе единицы по ОП градуировка уже нелинейно себя вести может. если у вас кривая до 2 ОП, то пожалуйста
(вообще ржачно: "примерно 1.0513")

ksm, не понимаю что здесь РЖАЧНОГО? у меня большой объём экспериментального материала и я назвала Вам первую плотность, которую в тетради посмотрела. Плотность всё же меняется и в зависимости от объекта и в зависимости от воздействия,и даже в зависимости от продолжитеьности воздействия. так что ничего ржачного и нет.

Esya
Постоянный участник
PA, USA

10.10.2016 16:03

URL #139

(Oceana777 @ 10.10.2016 07:36)

просто наше поколение еще на уроках физики учили округлять показания хотя бы до точности прибора... не указывать и не доволить рН до пятого знака, скажем

потому и ржачно, что вы даже в тетрадку занесли охрененное количество незначащих цифр

Поблагодарили (1): ksm

MMM
Постоянный участник

10.10.2016 16:45

URL #140

(ksm @ 05.10.2016 02:58)

Кстати, для обычного нормально работающего брэдфорда нелинейность начинается в районе 0,5-0,7 единицы D. Но опять же, кстати, СФ 2000 умеет строить криволинейные градуировки на основе линейных многочленов. Что касается точности измерений, ну, Брэдфорд вообще не подразумевает точность выше 10%. А допускает ошибки и в 50%. Например, при градуировке по бычьему альбумину, если измерять антитела, то ошибка больше чем в 2 раза.

Сообщение было отредактировано MMM - 10.10.2016 16:46

Поблагодарили (1): ksm

ksm
Постоянный участник

11.10.2016 16:57

URL #141

(Oceana777 @ 10.10.2016 16:36)

ну не КРИЧИТЕ так на меня!!!111111111

ksm
Постоянный участник

11.10.2016 17:31

URL #142

Уважаемая Oceana777, как писал вам МММ вам при ваших опттических плотностях необходима криволинейная градуировка по БСА с привлечением линейных многочленов. если вы используете просто линейный коэффициент в пересчете, то, боюсь, весь ваш большой объём экспериментального материала следует переизмерить, чтобы удовлетворить требованию к линейности (т.е. 0,5-0,7 по шкале ОП). это достигается серией разбавлений. а весь ваш колоссальный труд по измерению ОП в районе единицы для большого объема экспериментального материала необходимо просто познакомить с обыкновенным педальным ведром.

fargo

Томск, Россия

10.11.2016 15:37

URL #143

Если в среде содержатся полифенолы, возможно ли их учесть при определении белка по Лоури? Например, если рассчитать OD для фенолов в той же пробе используя карбонат и реактив Фолина, затем определить содержания белка в этой же пробе, используя добавочно медь. В итоге, полученная разность в показаниях OD должна соответствовать белку. Или так нельзя делать.

MMM
Постоянный участник

10.11.2016 16:12

URL #144

Да, делать-то мозьно, вот только если реакция на меди будет составлять доли процента реакции на Фолине без меди, то вас это не спасет. Т.е. такое возможно на хорощем приборе и при условии, что соотношение сигналов не превышает 1:1 , а лучще 5-30% от сигнала белка.

metrim
Постоянный участник
Москва

14.01.2017 14:42

URL #145

А продажные реактивы для Брэдфорд (Термо или Био-рад) - это та же самая рецептура, что приведена здесь? или туда добавляется что то для стабильности и повышения сроков хранения?

MMM
Постоянный участник

14.01.2017 16:53

URL #146

metrim! Это не вопрос для ответа. Как вообще подобные вопросы приходит в голову задавать на форуме студентов и научных сотрудников.

metrim
Постоянный участник
Москва

14.01.2017 23:33

URL #147

Что то не догоняю: в чем проблема вопроса или форума ....
Имеется ввиду что "сиречь есть страшная коммерческая тайна" ?

MMM
Постоянный участник

15.01.2017 20:25

URL #148

Да, даже если и тайна или не тайна, откуда научные сотрудники должны знать, что происходит на каком-то заводе.

Елизавета12345

09.03.2021 14:30

URL #149

Коллеги, подскажите почему может быть расхождение в концентрации белка при 280нм и при 595 ни (Бредфорд)?

guest: София
IP-штамп: frXzihUMrvb8M
гость

21.05.2021 13:39

URL #150

Здравствуйте! Готовлю реактив Бредфорда. Использую краситесь кумасси G250. При смешивании красителя со спиртом получается синий раствор. При добавлениии в полученный раствор ортофосфорной кислоты 85%( по каплям), раствор приобретал коричнево-вишневый цвет. После добавляла бидистиллят , раствор стал синим. При фильтовании через « синюю» ленту , раствор стал бледно голубо- фиолетовый. Ответ не белок не даёт. Я попробовала добавить кислоты больше, чем надо, получился раствор черно коричневый. При добавлении белка реагирует. Вопрос: зачем нужно доводить водой до метки ? Почему нельзя просто использовать спирт, кумасси и кислоту?

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.