molbiol.ru -> Мультиплекс

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Мультиплекс -- Микросателлиты --

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

Tormoz
Участник

02.10.2017 17:30

URL #1

Приветствую.
Готовим мультиплекс из 11 пар праймеров на микросателлитные локусы.
Этапы:
1. Подбираем примерно одинаковую температуру отжига.
2. Проверяем на образование димеров.
3. Праймеры, локусы которых с "пересекающимися" длинами аллелей, метим разными флюорофорами (всего 4 красителя FAM, TAMRA, R6G, ROX + стандарт. Анализ на секвенаторе AB 3500).

Вопрос, как подбирать концентрации праймеров для мультиплекса? Какие есть программы для этого?

Какие есть еще важные детали и "подводные камни" для создания мультиплексной панели?

Буду признателен за любые советы.

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

02.10.2017 19:29

URL #2

Значит, крокодил таки ловится?!

А что значит +стандарт?

Сообщение было отредактировано -Ъ- - 02.10.2017 19:56

Файл/ы:

A_novel_multiplex_PCR_assay_for_the_identification_of_Indian_crocodiles.pdf
размер: 132.9к
кол-во скачиваний: 182

Validation_of_a_Multiplex_PCR_Assay_for_the_Forensic_Identification_of_Indian_Crocodiles.pdf
размер: 336.63к
кол-во скачиваний: 129

Tormoz
Участник

02.10.2017 22:02

URL #3

Спасибо. Но мы тестируем коров. Размер и количество аллелей известно. Праймеры известны (ISAG). Температуры отжига также известны. Схемы ПЦР реакции есть. Проблема в том как готовить мix праймеров- нужно подбирать разные концентрации праймеров. В каком соотношении их смешивать непонятно. Если программа для этих целей.
Стандарт - имеется ввиду размерный стандарт канал Liz.

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

03.10.2017 14:14

URL #4

(Tormoz @ 02.10.2017 23:02)

Допустим размерный стандарт с LIZ Вы купите. Но матрикс стандарт с таким набором красок (FAM-R6G-TAMRA-ROX-LIZ) точно нигде не купите и не закажите, а TAMRA и ROX еще никому не удалось использовать на капиллярниках Аплайда, даже на 3500.
Про праймеры и мультиплекс я пока ничего говорить не буду (никакого смысла) и принципиально не согласен с Генсеком по поводу 3-штрих концов праймеров (теоретик он, что с него взять

):
http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/P...mer_Design.html
https://www.neb.com/tools-and-resources/usa...-dna-polymerase
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/P...r00205-0215.pdf

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

03.10.2017 14:19

URL #5

(Tormoz @ 02.10.2017 23:02)

У меня такое ощущение что Вы работаете со свиньями.

От крокодилов отказались, а количество локусов по коровам снизили до уровня свинячих.

А аллельные стандарты (ладдеры) будете делать?
Прикрепил книгу, читайте на досуге.

Сообщение было отредактировано -Ъ- - 03.10.2017 15:58

Файл/ы:

_Methods_in_Molecular_Biology_402__John_SantaLucia_Jr__auth.___Anton_Yuryev__eds.__PCR_Primer_Design_Humana_Press__2007_.pdf
размер: 8.19мб
кол-во скачиваний: 184

sceptique
Постоянный участник
временной жизни

03.10.2017 17:32

URL #6

Там всё очень сложно в оптимизации. Чем короче ампликон, тем меньше ему нужно сыпать праймеров. Зависимость конечного выхода от длины - примерно обратная экспоненциальная в реальности (в 2 раза короче апликон даст выход примерно в 5 раз бОльший в параллели с 1-ной длины конкурентом). Суммарный интеграл того, что может размножаться в растворе по мультиплексируемым локусам тоже конечен, то есть после некоторого разумного увеличения концентрации полимеразы в растворе (и риска схватить неспецифику) суммарно по выходу всех продуктов в реакции больше уже не становится. И пока не ухудшите выходы слишком хорошо амплифицирующихся локусов (путём снижения концентрации их праймеров или их укорочения) - слишком плохо получающиеся по выходу аллели лучше множиться не станут, как их праймеры не пересыпай.

Сообщение было отредактировано sceptique - 03.10.2017 17:33

Carbon Copy
Постоянный участник
So close no matter how far

04.10.2017 17:11

URL #7

Никаких программ для оптимизации концентрации праймеров не существует. Да и не нужны они, так как концентрация праймеров в мултиплексах не так уж и критична. Как вы думаете безумные ПЦР мультиплексы для секвенирования или раковые паннели подбирают? Навряд ли они сильно там с концентрациями сотен праймеров сильно возятся. Косяки с неравномерной амплификацией локусов в мультиплексной ПЦР начинаются только когда концентрация ДНК матрицы очень низка. А когда ДНК - вагон, всё и так ПЦР-ится более-менее нормально. На мой взгляд гораздо важнее мониторить димеры и комплементарность, что можно сделать AutoDimer https://www.hsls.pitt.edu/obrc/index.php?page=URL1154964478 .

Tormoz
Участник

04.10.2017 18:45

URL #8

(-Ъ- @ 03.10.2017 15:14)

):
http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/P...mer_Design.html
https://www.neb.com/tools-and-resources/usa...-dna-polymerase
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/P...r00205-0215.pdf

Tormoz
Участник

04.10.2017 18:53

URL #9

Для матрикс стандарта используется набор FAM, R6G, TAMRA, ROX,
DY632 (аналог LIZ).
На счет "еще никому не удавалось использовать TAMRA, ROX на капиллярниках Аплайда" слишком смелое заявление.

Прилагаю статью, правда только по свиньям.
На счет коров, то по ним у ISAG есть набор на 11 микросателлитов.

За советы и присланные материалы всем спасибо.

Файл/ы:

_____________________.pdf
размер: 1.06мб
кол-во скачиваний: 309

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

04.10.2017 19:58

URL #10

(Tormoz @ 04.10.2017 19:53)

Прилагаю статью, правда только по свиньям.
На счет коров, то по ним у ISAG есть набор на 11 микросателлитов.

За советы и присланные материалы всем спасибо.

У краски DY-632 Absorption/emission max. 637 nm / 657 nm
И как Вы его будете его возбуждать лазером 510 нм макс.?

Таких аналогов ЛИЗ - туева хуча

В статье могут не все написать, да, а я сам проверял собственноручно.

По поводу оптимизации мультиплекса согласен с предыдущими ораторами, все логично вроде бы, но это все близко к теории. Алгоритм оптимизации на практике оказался не простым, и многое зависит от выбора полимеразы и соответствующего буфера.

Сообщение было отредактировано -Ъ- - 04.10.2017 20:06

LMP
Постоянный участник

04.10.2017 21:25

URL #11

(-Ъ- @ 04.10.2017 17:58)

И как Вы его будете его возбуждать лазером 510 нм макс.?

У нанофора лазер 710

sceptique
Постоянный участник
временной жизни

04.10.2017 21:55

URL #12

488 у нанофора.

Поблагодарили (1): LMP

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

05.10.2017 12:03

URL #13

Два лазера? Во дают.

Уж больно далеко разнесены они по краям.
В самый раз и третий посередке сунуть.

Да уж, нанофор это легенда российского приборостроения.

Tormoz
Участник

05.10.2017 13:15

URL #14

Как ни странно, но DY-632 возбуждается лазером AB 3500
Практикас...это не теоретикас.

Tormoz
Участник

05.10.2017 13:16

URL #15

Да, а на счет ROX...у AB есть матричный стандарт с этим красителем.

Tormoz
Участник

05.10.2017 13:18

URL #16

Вру, ...стандарт длин

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

05.10.2017 13:28

URL #17

Я дал значения макс. значения длин волн, поглощения и излучения.
А теперь посмотрите на ее спектры (форму и перекрывания).
Да, квантовый выход мощный, но это не самое главное.
https://dyomics.com/en/products/red-excitation/dy-632.html

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

05.10.2017 13:35

URL #18

(Tormoz @ 05.10.2017 14:18)

Вру, ...стандарт длин

Значит, он есть и в матриксе. Ну и что?
Вы же собираетесь ROX-ом метить праймеры локусные!

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

05.10.2017 13:49

URL #19

(LMP @ 04.10.2017 22:25)

У нанофора лазер 710

Крутой лазер. Ссылку на такую технику, плз.

sceptique
Постоянный участник
временной жизни

05.10.2017 18:45

URL #20

(Tormoz @ 05.10.2017 14:15)

Как ни странно, но DY-632 возбуждается лазером AB 3500
Практикас...это не теоретикас.

Возбуждается, тока с эффективность процентов 5-10 от максимальной. Соответственно, снижается чувствительность канала по этому красителю минимум в 10 раз (минимум - поскольку это еще до спектрального межканального вычитания). То есть STR-продукта нужно иметь минимум в 10 раз больше с этоё краской, чем с FAM-ом для такого же сигнала-пика с выхода капилляра.

Такие краски вешают на праймеры только от полной безнадёги развести продукты по длине и в 2-3 нормальных красках, хорошо горящих на 488нм.

Я лично много хорошего читал про ROX, но на поверку оказалось говнецом на детекторе, хотя оптимизации по всему остальному были абсолютными по всему пространству параметров. Ни для чего кроме внутрирастворного референса для поправки на испарение под светом 488нм он не пригоден. Стандарты длин советую Вам заказывать строго на LIZ.

Сообщение было отредактировано sceptique - 05.10.2017 18:51

LMP
Постоянный участник

05.10.2017 19:52

URL #21

(-Ъ- @ 05.10.2017 11:49)

Крутой лазер. Ссылку на такую технику, плз.

То хи-хи, то ссылку. Вы уж определитесь

kblag
Постоянный участник

05.10.2017 22:03

URL #22

Если мультиплекс делаете для себя, то, для начала, посчитайте затраты + время на его создание и сравните с числом потенциальных коров. Возможно и браться не стоит.
А если всё равно очень хочется мультиплекса, то есть те, кто занимается этим профессионально - опять же, может оказаться дешевле перепоручить.

Сообщение было отредактировано kblag - 05.10.2017 22:06

Поблагодарили (1): -Ъ-

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

06.10.2017 10:30

URL #23

(LMP @ 05.10.2017 20:52)

То хи-хи, то ссылку. Вы уж определитесь

Не хи-хи, а ха-ха по поводу двух лазеров.

Предлагаю третий лазер - и никаких проблем с мечением праймеров. (ха-ха)
А ссылку не надо, не отвлекайтесь от важных дел.

sceptique
Постоянный участник
временной жизни

06.10.2017 10:43

URL #24

Интересно, а стоит ли экспертиза коровы по STR тех денег, которые тратятся на её разработку? Неужели их так часто угоняют или контрабандой в виде мяса поставляют по фальшивым накладным? Топикстартер, накой вам это всё сдалось?

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

06.10.2017 10:46

URL #25

(kblag @ 05.10.2017 23:03)

В том то и дело выделяются деньги на подобные "разработки". Если это частник и хочет иметь свой тест - никаких возражений, только рад помочь.
Если бы это было эдак лет 20 назад...

У меня уже все это барахло типа разработано (бык,лошадь, свинья, человек, собака, а крокодила нет - чего нет, того нет

) ну и что? Берите, производите!
Нееет, нельзя чтоб было так просто, не по понятиям - не я так другой "отпилит" свой кусок.

Поблагодарили (1): kblag

kblag
Постоянный участник

06.10.2017 11:06

URL #26

Смею предположить, что это для определения пород, а не против краж

Хотя...если на месте преступления есть следы коровы...

А я бы про лазер почитал!!!

LMP
Постоянный участник

06.10.2017 11:58

URL #27

(sceptique @ 06.10.2017 08:43)

Интересно, а стоит ли экспертиза коровы по STR тех денег, которые тратятся на её разработку?

вы никогда не ели кошатину по цене говядины? Уверены?

В банке фиг различишь

kblag
Постоянный участник

06.10.2017 12:47

URL #28

(LMP @ 06.10.2017 12:58)

вы никогда не ели кошатину по цене говядины? Уверены?

В банке фиг различишь

это не STRами смотрят! STR для проверки - правильная ли новозеландская мраморная говядина у Вас в стейке или нет

Поблагодарили (2): sceptique, LMP

sceptique
Постоянный участник
временной жизни

06.10.2017 12:58

URL #29

(LMP @ 06.10.2017 12:58)

вы никогда не ели кошатину по цене говядины? Уверены?

В банке фиг различишь

Кошатина и крысятина с ворониной не могут быть дешевле говядины, ибо у сих животных почти нет мяса и за ними нужно долго бегать в отличие от коров и свиней. Мне кажется, подделывать более дешевое сырье более дорогим безсмысленно и нерентабельно.

(kblag @ 06.10.2017 13:47)

это не STRами смотрят! STR для проверки - правильная ли новозеландская мраморная говядина у Вас в стейке или нет

Ну, вот, значит все же для пресечения контрабанды и подделок мяса, значит. Где линейность пород безусловно важна.

Сообщение было отредактировано sceptique - 06.10.2017 13:00

Sod
Постоянный участник
Москва

06.10.2017 23:07

URL #30

(Tormoz @ 02.10.2017 15:30)

Если мультиплексная панель не получится, то напишите мне, я помогу Вам посчитаю панель.

Сообщение было отредактировано Sod - 06.10.2017 23:50

watchesbiz
Постоянный участник

23.11.2021 14:54

URL #31

https://archives.profsurv.com/forum/Profess...ert/-67881.aspx
https://atlanta.bubblelife.com/community/an...ex_Watch_Online
https://gumroad.com/rolexrelicawatches/p/di...replica-watches
https://onmogul.com/stories/guide-on-how-to...ex-watch-online
https://list.ly/i/5704105
https://www.behance.net/gallery/114237003/Replica-Rolex
https://www.mlbdailydish.com/users/Replicarolexwatches
http://replicawatches24.simplesite.com/
https://watcheshutuk.cabanova.com/
https://www.pinterest.com/watcheshutuk/_saved/
https://www.linkedin.com/pulse/guide-how-pu...online-hei-bai/
https://justpaste.it/8t11q
https://padlet.com/watcheshutuk/in2opwnfmnmclce8
https://www.allforxi.com/users/Replicarolexwatches
https://profile.hatena.ne.jp/Rolexrelicawatches/profile

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.