Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Эффективность ПЦР
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Galya4595




 прочитанное сообщение 19.06.2018 18:49     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Здравствуйте! Порекомендуйте, пожалуйста, как модифицировать условия амплификации, чтобы добиться хороших показателей эффективности, в нашем случае понизить эффективность ПЦР? В одной пробирке амплифицируется целевой ген (ROX) и референсный ген (FAM), используем TaqMan зонды. Для первой постановки использовалась следующая программа амплификации: прогрев реакционной смеси при температуре 50°С в течение 30 секунд; денатурация смеси при 95°С, 90 секунд; инкубация смеси при 60°С, 50 секунд; денатурация смеси при 95°С, 15 секунд. Во втором случае изменили температуру отжига (с 60°С до 65°С) и уменьшили концентрацию зондов для целевого гена.

Картинки:
картинка: ___________2.JPG
___________2.JPG — (149.21к)   

картинка: ___________1.JPG
___________1.JPG — (156.94к)   

Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 19.06.2018 19:58     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

А в чем состояла задача повышения температуры отжига/элонгации?

Надо было не концентрацию зонда понижать, а уменьшать их длину.
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 19.06.2018 20:35     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

пипетки проверены, которыми титруете смесь?
что на кривой плавления или на электрофорезе?
Участник оффлайн! Carbon Copy
Постоянный участник
So close no matter how far



 прочитанное сообщение 19.06.2018 22:45     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

На мой взгляд всё выглядит достаточно пристойно и оптимизация не требуется - слопы почти одинаковые и прямые параллельны, и y-intercept-ы очень близки. Единственное, я бы продолжил разбавлять кДНК (или РНК?) и посмотрел, как ведут себя реакции при низких концентрациях матрицы - нет ли взаимного ингибирования. Мультиплекс ROX/FAM тоже не обязателен - гораздо точнее измерения, когда реакции на целевой ген и хаузкипер идут в разных пробирках. Но, в данном конкретном случае похоже, что уровни экспресси близки или идентичны, поэтому можно и комбинировать. Какова ожидаемая разница в еkспрессии между контролем и экспериментом?

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): -Ъ-
Участник оффлайн! Galya4595




 прочитанное сообщение 20.06.2018 18:21     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Спасибо за ответы! Температуру отжига повышали, чтобы снизить количество неспецифики, к тому же, при повышении температуры эффективность действительно снизилась в сторону приемлемых значений (первый прикрепленный рисунок).
Пипетки проверяли, всё в норме. После электрофореза продукт был одного размера, без шмира.
В данном эксперименте мы не оцениваем уровень экспрессии, конкретно занимаемся анализом делеций/дупликаций в целевом гене. Завтра как раз планируем большее разбавление ДНК.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 21.06.2018 13:48     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Как правило, эффективность ПЦР - показатель суммарный, т.е. все оптимизировано, все пучком!
В принципе можно изменить эффективность и за счет температурных режимов цикла, но не зная природу фермента или зонда трудно что-то советовать.
Участник оффлайн! semi
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 16.09.2018 21:32     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

(Galya4595 @ 20.06.2018 19:21)
Ссылка на исходное сообщение .... Температуру отжига повышали, чтобы снизить количество неспецифики, к тому же, при повышении температуры эффективность действительно снизилась в сторону приемлемых значений (первый прикрепленный рисунок).
....

Во второй раз у вас снизился выход продукта реакции, но эффективность реакции по прежнему выше 110%. Сравните RFU.

Мне кажется, дело в разведении стандартов. Мне кажется, шаг разбавления в 2 раза не годится для построения калибровочной кривой. Тут дело даже не в криворукости, а в том, что двукратная разница слишком близка к порогу разрешающей способности для real-time PCR.
Вот ваши разведения, если считать реакцию 100% эффективной:
1,65
1,87
1,91
2,01

2,51
1,28
2,05
1,81
1,98

В первом эксперименте, если убрать первую самую плохую точку, то slope снизится до -3,1, т.е, эффективность чуть снизится - до 107%.
Во втором эксперименте, убрать вторую точку и slope станет равным 3,01, и эффективность снизится с 121% до 113%.

Лучше все-таки провести серийные десятикратные разведения. Десятикратные разведения более устойчивы к ошибкам пипетирования и ошибок самих пипеток. Заодно увидите предел чувствительности для вашей системы. Не забывать менять носики и хорошо перемешивать растворы.

И надо вернуться к первому варианту температурных режимов и концентрации пробы.

Сообщение было отредактировано semi - 16.09.2018 22:01
Участник оффлайн! semi
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 19.09.2018 09:32     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

Пропала Галя..
Ну и ладно.
Участник оффлайн! Galya4595




 прочитанное сообщение 02.10.2018 10:01     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

Спасибо большое за помощь, вопрос был решен.
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  19.11.2021 15:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

https://app.ex.co/stories/bestreplicawatche...-regime-for-you
https://rolexrelicawatches.hpage.com/replica-watches-uk.html
https://www.cgmimm.com/articles/hints-to-he...lica-watches-uk
https://www.deviantart.com/fakerolexwatches...es-UK-871090193
https://replicawatches24.exposure.co/best-r...eplicawatches24
https://knowyourmeme.com/users/replicawatchesuk
https://www.scoop.it/topic/bestreplicawatch...ica-rolex-watch
https://uberant.com/article/1268140-hints-o...ca-rolex-watch/
https://devpost.com/watcheshutuk
https://www.ted.com/profiles/26540630/about
https://drive.google.com/file/d/1uTx90WraSJ...iew?usp=sharing
https://ibb.co/hgfZwb0
https://writer.zohopublic.com/writer/publis...10192bd4c742ceb
https://replicawatches24.mystrikingly.com/b...ica-rolex-watch
https://my.desktopnexus.com/ReplicawatchesU...a-rolex--31049/
https://sway.office.com/Tqm7mC7s0VWLhKAl
Участник оффлайн! watchesonline89
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  26.12.2022 10:31     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

https://blog.udn.com/omegawatches89/176264446
https://teletype.in/@omegawatches89/CDyEM0Nch4X
https://wakelet.com/wake/7vB7d1grH5yswj4a12XAi
https://www.tripadvisor.it/Profile/352omegaw
https://homeinspectionforum.net/user/profile/72707.page
https://slidebatch.com/content/item/1353
https://omegawatches89.seesaa.net/article/490300679.html
https://slidebatch.com/profile/reactions
https://www.friday-ad.co.uk/profile/watches-s-co6llqqCqg==/
https://www.craftsforum.co.uk/forum/your-cr.../1130892-moulds
https://ameblo.jp/omegawatches89/entry-12756687889.html
https://telegra.ph/Reasons-Why-Replica-Watc...o-Popular-08-03
https://teletype.in/@omegawatches89/gUADjwow_lO
https://omega-watches-2.jimdosite.com/
https://plaza.rakuten.co.jp/omegawatches89/...y/202208040001/
https://list.ly/i/8020064
https://www.pearltrees.com/omegawatches89/item456651158

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 29.03.24 10:56
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft