По моему скромному мнению стабильность олигов зависит от их нуклеотидного состава. Некоторые праймеры довольно быстро перестают работать в ПЦР, приходится перезаказывать, а некоторые действительно по 10 лет - и без проблем.
Хотя, конечно, возможно что дело не только в нуклеотидном составе...

И нам тоже протокол интересен!

А у меня такая идея появилась:
Факт1: Exoribonuclease I degrades single-stranded RNA from 5'-to-3'
Факт2: Кэпированную РНК Exoribonuclease I не деградирует.
Так что эксперимент получается простой, только надо выделенную мРНК использовать, не уверен, что тРНК/рРНК будут деградировать.
Этот фермент (дрожжевая XRN-1) продается в NEB.

Честно говоря, я выделял РНК из мышиной кожи китом QIAGEN, тризолом выход был совсем уж небольшой. Но обнаружено, что критическая стадия - это измельчение кожи. Я резал кожу скальпелем с жидким азотом до ОЧЕНЬ МЕЛКОГО порошка (3-4 раза). А затем потереть еще с RLT прямо в ступке.

Есть РНК и кДНК с хувеков. Сойдет?

Скорее всего, Вы не использовали external well factor, что необходимо делать в таком варианте ПЦРа.

Тоже интересовался. Нагуглил в патентах, дословно:
"RLT buffer denotes a standard commercial buffer (obtainable from Messrs. QIAGEN
, Hilden) based on a guanidinium salt such as eg guanidinium isothiocyanate and an alkali metal salt of a polybasic organic acid, as well as beta-ME, which buffers at pH 7"

Долой скрытность!

1. Можно. Мешали уже. Получается хуже, чем коммерческий.
2. согласен.
3. Тогда я ненормальный. У меня отлично выделяются РНК и белки из других тканей мышей и делается это элементарно: добавляется ацетон к тому, что не задержалось на колонке RNeasy. Всем рекомендую.

Насчет скупости: меня не жаба душит, а мизерное количество материала.

Спасибо большое за ответ. Но, это всего лишь вариант Тризола, и я не знаю, какие реальные выходы РНК и белков получаются с триреагентом от амбиона. Покупать реагент только для предварительных опытов нерационально, хотелось бы услышать мнение тех, у кого стояла похожая задача.

Уважаемые коллеги,

есть ли у кого положительный опыт одновременного выделения РНК и белков из мышечной ткани? По отдельности всё выделяется ОК, но материала для выделения очень уж мало, а сделать хочется много
Для выделения РНК мы используем протеиназу К + RNeasy kits. Тризолом получается маловато и грязновато (может, какие-то тонкости там есть?). РНК понадобится для RTи real-time PCR, а белки для вестернов.

Пока что у меня есть подозрение, что по выходу РНК и белков одновременное выделение есть не самый удачный вариант.
Прав ли я?

Очень странно. У меня разброс не превышал 1-3% для концентраций выше 100 нг/мкл. Видимо, у Вас какая-то проблема с прибором.

-Именно так! Есть большая коллекция кДНК клонов вирусов растений, можно ее использовать.

-Насчет РТ с тотальной ДНК - это просто очепятка, сорри.

-Насчет обычной процедуры с частично вырожденными праймерами-РТ-ПЦР-сиквенс-RACE - это всё мне, конечно, известно, но ведь хочется иногда поизвращаться... А массовое секвенирование кДНК-библиотеки всё дешевле и дешевле...

2 genseq:
Спасибо! Написал в личку.

2 ship:
Ну, есть такая надежда, что такой самопал может помочь избирательно обогатить смесь ДНКи. Ну например: заражено растение каким-то вирусом, примерно понятно каким. Тогда я выделяю тотальную ДНКу, и ставлю RT c такими самопальными праймерами, полученными из кДНК клона вируса-родственника.
Или еще можно что-нибудь придумать... Главная цель - специфическое обогащение пула ДНК из сложной смеси.

2 RJ Dio:
Я разоблачен! Не понимаю, как Вы смогли догадаться о моих опытах по зарождению жизни на трупиках бактерий?

2 guest: ммм
Что-то с ДНКазой у меня получается слишком широкий набор фрагментов с преобладанием 10-12 нт (резал DNAseI Fermentas + Mg). А хотелось бы получить небольшой и приятненький узенький пичок...

Спасибо за ответ. Действительно, если этот велосипед уже изобретали то можно и не мучаться. Разве что чуть-чуть...

Уважаемые коллеги!
Появилась идея нарезать ДНК на короткие олиги, которые можно потом использовать для "полуспецифических" реакций обратной транскрипции, или как "праймеры" для real-time PCR.
ДНК из бактерий была выделена обычными методами + РНКаза, потом стал ее нарезать следующими способами:
1. Кипячение в воде. Действует живительно, ДНК разрушается за несколько часов до фрагментов нужных размеров (15-50нт). Правда, непонятно что с 3'-концами этих молекул. Кто что думает по этому поводу? Пробовал проверить работоспособность этих "праймеров" real-time PCR - что-то ничего не получилось...
2. Ультразвук. Прибор был советский, разрушить до олигов не удалось, а в ушах до сих пор стоит звон .
3. ДНКаза. Режет на оч. широкий диапазон фрагментов, видимо, для моих целей не подходит.

Есть ли еще идеи как можно это сделать?
Заранее благодарен за любые советы, кроме комментариев типа "Зачем вообще с этим связываться?"

Не соглашусь с предыдущим постом.
Наготовил 3 года назад по молбиоловской методике 100 аликвот Т-вектора, до сих пор пользуюсь, всё ОК.
Единственный момент - вырезание из геля и самолигирование проводил два раза, в итоге НИКОГДА не вырастает пустых клонов.
Работайте!

Для этой цели мы используем Onto Tools, она учитывает направление регуляции и выдаёт разумные pathways. В NAR'e есть пара статей про неё в открытом доступе.
http://vortex.cs.wayne.edu/projects.htm#Onto-Express

Есть pET 3a, 22b+, 20b

К последнему посту: я использовал этот метод, работает неплохо, но требует очень качественных реактивов и хорошей ПЦР-машины.

Извините за оффтоп: если вы в Москве, то у кого покупаете Еву?

Честно говоря, четкого определения правомочности я дать не могу Просто эмпирически подбираю такой диапазон Ct для baseline, чтобы кривая выглядела по-человечески. При ранней амплификации часто работают значения 2ой-5ый цикл, или 3ий-6ой.

Это известная проблема, возникающая при ранней (Ст до 10-15) амплификации. Бороться с этим можно или разводя матрицу (что я бы и делал), или вручную "играясь" с baseline settings, подбирая ее индивидуально для каждой кривой (не всякий софт это позволяет, я использую биорадовский для IQ5)

Пожалуйста!
Кому не жалко поделиться антителами на 5-6 иммуноблотов? Возможен обмен на др. антитела или реактивы.
Антитела пригодятся любые, к любым субъединицам комплексов I, III и IV.

Пишите на e-mail zinovkin@genebee.msu.su
Спасибо заранее!

Ссылка на реферат статьи пустая!