Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
tovaroved |
до этого имел дело с буфером на хлориде калия, отличчно работает в моем исполнении. Приготовил буфер, а потом мысль поситила, аммоний сульфат ведь должен иметь буферные свойства, а его рН 1М раствора 5.0-6.0, видимо его на додовести до какогото значения лучшего для полимеразы, с помощью раствора аммиака? попробовал сделать просто, без доведения рН 1x 75 мМ ТрисHCl рН8,8 20 мМ (NH4)2SO4 плюс 8% глицерин, БСА до 0,1 мг/мл, Твин20 0,1%, ксиленцианол 0,1 мг/мл (это чтоб сразу на форез наносить), работает немного хуще чем коммерческий (там 67 мМ Трис и 17 мМ сульфата, при таких концентациях обеих солей хуже раза в два-три). Подскажите что не так, заранее благодарен |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
можно тока трис БСА и ксилен ? это ферментас с добавками - БСА неизвестно какой а ксилен можно махнуть на крезол |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
|
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
отдельно а потом сравнить - а так не понятно |
serhiosus Участник Minsk |
При добавлении глицерола до 5% в 1Х наблюдал ухудшение некоторых амплификаций. А так, все отлично, причем трис у меня не molbiol grade, а взятый из старых пожелтевших запасов и переосажденный в спирту. сульфат - 80-годов, правда ОСЧ, Tween 20 техже времен. |
distemper Постоянный участник |
скажу еще одно-я как-то 5 разных полимераз (в смысле производителей) прогонял по разным буферам, дык вот этот работает безотказно с любым ферментом. Самый он так сказать универсальный на мой взгляд. ЗЫ: магний лучче тоже сернокислый, хотя может это мое так сказать сукбъективное ощущение |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(serhiosus @ 14.12.2006 12:06) Давно работаю на буфере 10Х (650 мМ Трис рН 8,8 + 160 мМ Сульфат + 2% Тщеен 20) , без глицерола и БСА. Срабатывает не хуже, а иногда и лучше чем Ферментас. При добавлении глицерола до 5% в 1Х наблюдал ухудшение некоторых амплификаций. А так, все отлично, причем трис у меня не молбиол граде, а взятый из старых пожелтевших запасов и переосажденный в спирту. сульфат - 80-годов, правда ОСЧ, Тщеен 20 техже времен. глицерол, сахароза,фикол + ксилен - это чтоб прямо в гель ксилен может ингибировать - нужно титроватъ либо пробовать крезоловый красный БСА - вроде нафиг не нужен - можно еще в тот "БСА" вляпаться |
serhiosus Участник Minsk |
(distemper @ 14.12.2006 10:26) скажу еще одно-я как-то 5 разных полимераз (в смысле производителей) прогонял по разным буферам, дык вот этот работает безотказно с любым ферментом. Самый он так сказать универсальный на мой взгляд. ЗЫ: магний лучче тоже сернокислый, хотя может это мое так сказать сукбъективное ощущение Насчет магния - и хлористый вполне нормально работает. Недавно тестировал серию буферов на основе смеси сульфата и калий хлора. Для небольших фрагментов (300bp) лучше срабатывал mix (NH4)2SO4 - 16 мМ + KCl - 10 мМ. По литературке такие буферчики более толерантны к температуре отжига и магнию. |
tovaroved |
Конкретно занимался опробыванием новых смесей на буфере с КCl, там все замечательно, ксилен доводил до концентрации 0,08мг/мл, никакого существенного влияния не оказывал, завтра попробую конечно и с крезоловым. До этого пытался использовать сахарозу для увеличения плотности раствора (чтоб сразу на форез), но чтото не заладилось, она ингибирова раза в три-четыре, так что работать с ней не стал (как основной использовал буфер от ферментас с сульфатом), сахарозу нрадо было б другую проверить, но под руками не было, а заказывать... сказываются финансовые проблемы института. Поэтому решил попробовать на глицерине, как исходный взял от набора "Института Эпидемиологии". Как мне кажется все проблемы связваны с потерей буферных свойств при реакции, был опыт: сравнивал работу буферов на КCl с 100 и 500 мМ Трис, 500 мМ гораздо лучше, так и с сульфатом повысил содержание с 67 до 75 мМ заметное улучшение, интересно как много можно вообще Триса в реакцию вводить? |
tovaroved |
(Guest @ 13.12.2006 13:45) ссылки не грузятся, сегодня сервер не работает? |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(serhiosus @ 14.12.2006 13:18) Насчет магния - и хлористый вполне нормально работает. Недавно тестировал серию буферов на основе смеси сульфата и калий хлора. Для небольших фрагментов (300бп) лучше срабатывал мих (НХ4)2СО4 - 16 мМ + КЦл - 10 мМ. По литературке такие буферчики более толерантны к температуре отжига и магнию. вроде про этот буферочек QIAGEN уже давно всем уши прожжуал |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(tovaroved @ 14.12.2006 13:55) вроде работает www.bio.net потом "cresol " потом "search" |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(tovaroved @ 14.12.2006 13:50) Спасибо. Конкретно занимался опробыванием новых смесей на буфере с КЦл, там все замечательно, ксилен доводил до концентрации 0,08мг/мл, никакого существенного влияния не оказывал, завтра попробую конечно и с крезоловым. До этого пытался использовать сахарозу для увеличения плотности раствора (чтоб сразу на форез), но чтото не заладилось, она ингибирова раза в три-четыре, так что работать с ней не стал (как основной использовал буфер от ферментас с сульфатом), сахарозу нрадо было б другую проверить, но под руками не было, а заказывать... сказываются финансовые проблемы института. Поэтому решил попробовать на глицерине, как исходный взял от набора "Института Эпидемиологии". Как мне кажется все проблемы связваны с потерей буферных свойств при реакции, был опыт: сравнивал работу буферов на КЦл с 100 и 500 мМ Трис, 500 мМ гораздо лучше, так и с сульфатом повысил содержание с 67 до 75 мМ заметное улучшение, интересно как много можно вообще Триса в реакцию вводить? Лайтцыклер со стеклянными капиллярами работает на ЧИСТОМ Трисе 50 мМ конечная - никаких KCl |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(tovaroved @ 14.12.2006 13:50) Спасибо. Конкретно занимался опробыванием новых смесей на буфере с КЦл, там все замечательно, ксилен доводил до концентрации 0,08мг/мл, никакого существенного влияния не оказывал, завтра попробую конечно и с крезоловым. До этого пытался использовать сахарозу для увеличения плотности раствора (чтоб сразу на форез), но чтото не заладилось, она ингибирова раза в три-четыре, так что работать с ней не стал (как основной использовал буфер от ферментас с сульфатом), сахарозу нрадо было б другую проверить, но под руками не было, а заказывать... сказываются финансовые проблемы института. Поэтому решил попробовать на глицерине, как исходный взял от набора "Института Эпидемиологии". Как мне кажется все проблемы связваны с потерей буферных свойств при реакции, был опыт: сравнивал работу буферов на КЦл с 100 и 500 мМ Трис, 500 мМ гораздо лучше, так и с сульфатом повысил содержание с 67 до 75 мМ заметное улучшение, интересно как много можно вообще Триса в реакцию вводить? наскоко помню 75 мМ Трис без солей был впервые описан для сиквенса а потом для ПЦР ГЦ богатых темплатов годик так 1992 |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Guest @ 14.12.2006 15:22) наскоко помню 75 мМ Трис без солей был впервые описан для сиквенса а потом для ПЦР ГЦ богатых темплатов годик так 1992 1: Proc Natl Acad Sci U S A. 1988 Dec;85(24):9436-40.Click here to read Click here to read Links DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA. * Innis MA, * Myambo KB, * Gelfand DH, * Brow MA. Department of Microbial Genetics, Cetus Corporation, Emeryville, CA 94608. The highly thermostable DNA polymerase from Thermus aquaticus (Taq) is ideal for both manual and automated DNA sequencing because it is fast, highly processive, has little or no 3'-exonuclease activity, and is active over a broad range of temperatures. Sequencing protocols are presented that produce readable extension products greater than 1000 bases having uniform band intensities. A combination of high reaction temperatures and the base analog 7-deaza-2'-deoxyguanosine was used to sequence through G + C-rich DNA and to resolve gel compressions. We modified the polymerase chain reaction (PCR) conditions for direct DNA sequencing of asymmetric PCR products without intermediate purification by using Taq DNA polymerase. The coupling of template preparation by asymmetric PCR and direct sequencing should facilitate automation for large-scale sequencing projects. PMID: 3200828 [PubMed - indexed for MEDLINE] |
curious67 Постоянный участник |
|
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(tovaroved @ 13.12.2006 15:28) Не давно решил попробовать приготовить буфер на сульфате аммония, до какой поры работать на коммерческих? до этого имел дело с буфером на хлориде калия, отличчно работает в моем исполнении. Приготовил буфер, а потом мысль поситила, аммоний сульфат ведь должен иметь буферные свойства, а его рН 1М раствора 5.0-6.0, видимо его на додовести до какогото значения лучшего для полимеразы, с помощью раствора аммиака? попробовал сделать просто, без доведения рН 1х 75 мМ ТрисХЦл рН8,8 20 мМ (НХ4)2СО4 плюс 8% глицерин, БСА до 0,1 мг/мл, Твин20 0,1%, ксиленцианол 0,1 мг/мл (это чтоб сразу на форез наносить), работает немного хуще чем коммерческий (там 67 мМ Трис и 17 мМ сульфата, при таких концентациях обеих солей хуже раза в два-три). Подскажите что не так, заранее благодарен Mr.LongPCR - использовал слегка другой буфер |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Guest @ 18.12.2006 09:48) |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Guest @ 14.12.2006 13:00) глицерол, сахароза,фикол + ксилен - это чтоб прямо в гель ксилен может ингибировать - нужно титроватъ либо пробовать крезоловый красный БСА - вроде нафиг не нужен - можно еще в тот "БСА" вляпаться в пцр вроде можно совать "пищевые красители" в качестве индикаторов возьмите Тархун - из него "зеленую смесь" и в ПЦР |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(curious67 @ 16.12.2006 22:57) да-а-а, а я помнится, в 91-ом только начал ручной Сэнгер с секвеназой осваивать, и еще достигуха было- по двуцепочке секвенили, уже не надо было одноцепочку выделять. Знал бы тогда, как все запущено у нас- никогда б не стал продолжать. Спасибо, напомнили, атас... Не за что Начинать ПЦРитъ в 1991 - нормально Тока 3 года потерял |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Guest @ 18.12.2006 10:46) 1: Nature. 1987 Nov 26-Dec 2;330(6146):384-6.Click here to read Links Characterization of beta-thalassaemia mutations using direct genomic sequencing of amplified single copy DNA. * Wong C, * Dowling CE, * Saiki RK, * Higuchi RG, * Erlich HA, * Kazazian HH Jr. Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, Maryland 21205. Direct sequencing of specific regions of genomic DNA became feasible with the invention of the polymerase chain reaction (PCR) which permits amplification of specific regions of DNA. Recently, human mitochondrial DNA was amplified and directly sequenced. Using a thermostable DNA polymerase of T. aquaticus (Saiki, R.K. et al., manuscript in preparation) in the PCR, we have applied a combination of PCR and direct sequence analysis of the amplified product to a human single-copy gene. We studied the genomic DNA of five patients with beta-thalassaemia whose mutant alleles were uncharacterized, and found two previously undescribed mutations, along with three known alleles. One new allele is a frameshift at codons 106-107 and the other is an A-C transversion at the cap site (+1) of the beta-globin gene. This latter is the first natural mutation observed at the cap site and it occurs in a gene which is poorly expressed. |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(serhiosus @ 14.12.2006 12:06) Давно работаю на буфере 10Х (650 мМ Трис рН 8,8 + 160 мМ Сульфат + 2% Тщеен 20) , без глицерола и БСА. Срабатывает не хуже, а иногда и лучше чем Ферментас. При добавлении глицерола до 5% в 1Х наблюдал ухудшение некоторых амплификаций. А так, все отлично, причем трис у меня не молбиол граде, а взятый из старых пожелтевших запасов и переосажденный в спирту. сульфат - 80-годов, правда ОСЧ, Тщеен 20 техже времен. Согласен - в полипропилене нормально работает - но в стекле фиг 1: Bioorg Khim. 1997 Jun;23(6):526-8. Links [Fast DNA amplification in small ultrathin-wall microplates] [Article in Russian] * Tret'iakov AN, * Pantina RA, * Kaboev OK. A new method was developed for fast DNA amplification by polymerase chain reaction in tiny ultrathin microplates formed directly on the thermocycler's thermoblock. The microplates are made from thin (40-60 microns) polypropylene film by the thermal vacuum-formation method. Due to the effective heat transfer to 10-15 microliters samples and a high velocity of heating and cooling of the thermoblock (up to 7 degrees C/s), the total duration of the DNA amplification (30 cycles) is only 15-30 min. PMID: 9265475 [PubMed - indexed for |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Guest @ 18.12.2006 11:25) Согласен - в полипропилене нормально работает - но в стекле фиг 1: Bioorg Khim. 1997 Jun;23(6):526-8. Links [Fast DNA amplification in small ultrathin-wall microplates] [Article in Russian] * Tret'iakov AN, * Pantina RA, * Kaboev OK. : Anal Biochem. 1990 May 1;186(2):328-31. Links Minimizing the time required for DNA amplification by efficient heat transfer to small samples. * Wittwer CT, * Fillmore GC, * Garling DJ. Department of Pathology, University of Utah Medical School, Salt Lake City 84132. Hot-air temperature cycling of 1- to 10-microliters samples in glass capillary tubes can amplify DNA by the polymerase chain reaction in 15 min or less. A rapid temperature cycler of low thermal mass was constructed to change sample temperatures among denaturation, annealing, and elongation segments in a few seconds. After 30 cycles of 30 s each, a 536-bp beta-globin fragment of human genomic DNA was easily visualized with ethidium bromide on agarose gels. With rapid cycling, amplification yield depended on polymerase concentration. The time required for DNA amplification can be markedly reduced from prevailing protocols if appropriate equipment and sample containers are used for rapid heat transfer to the sample. PMID: 2363506 [PubMed - indexed for MEDLINE] |
суннатилла |
как влияет хлорид аммония на температуру реакции в пцр ? |
kenseq Участник |
(tovaroved @ 13.12.2006 17:28) Не давно решил попробовать приготовить буфер на сульфате аммония, до какой поры работать на коммерческих? до этого имел дело с буфером на хлориде калия, отличчно работает в моем исполнении. Приготовил буфер, а потом мысль поситила, аммоний сульфат ведь должен иметь буферные свойства, а его рН 1М раствора 5.0-6.0, видимо его на додовести до какогото значения лучшего для полимеразы, с помощью раствора аммиака? ну куй его знаэт я пцр в этом буффере делал в 1994 30 циклов за 15 минут могу скинут ПубМед |
kenseq Участник |
|
kenseq Участник |
|
kenseq Участник |
(суннатилла @ 04.07.2019 14:48) никак |
kenseq Участник |
Подскажите что не так, заранее благодарен глицерин и бса глицерин енто для лонг пцр когда в голову вэбло пцрит 20 кб товаровед ты есцо бетаин туды за***ч для полного счастя товаровед енто к пцр психам которые пцрят 20 кб бца добавляли 30 лет назад чтоб полимераза не горела а так сойдет твин или тритон |
kenseq Участник |
(kenseq @ 09.07.2019 13:07) |
kenseq Участник |
кстати вот тут тоге аммоний |
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |