molbiol.ru -> Осаждение белков трихлоруксусной кислотой

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Осаждение белков трихлоруксусной кислотой -- comments to a permanent page of the site --

Тема связана с: Осаждение белков ТХУ
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

Forum robot
Постоянный участник
на сервере в Москве

06.06.2005 18:54

URL #1

Осаждение белков трихлоруксусной кислотой. Метод полезен, когда концентрация белка в растворе слишком мала для анализа, или объем слишком велик, чтобы нанести нужное количество белка на гель.

к
IP-штамп: frQtbDwjgPMwo
гость

06.06.2005 18:54

URL #2

По моему опыту получается, что количество соосадителя завышено раз в 10, что приводит к существенным потерям на стадии промывания.

_Sanya_
IP-штамп: frftLGqhpFF.A
гость

11.01.2006 02:33

URL #3

К пункту 8.
Осадок белка можно промывать однократно ледяным ацетоном (80% - 100%)

Serg-66

30.11.2006 02:40

URL #4

Что-бы, при отмывке белка ацетоном не осаждались соли (что не очень хорошо при электрофорезе) можно предварительно промыть осадок 1 мл 10% ТХУ

Layelleth

25.01.2007 18:06

URL #5

Сработает ли осаждение ТХУ, если мне нужно отделить белок от липидов перед электрофорезом?
- Липиды по моему опыту очень мешают обычному денатурирующему форезу в ПААГ - если их много. А в моем случае липидов много

Tom1
Постоянный участник

25.01.2007 18:40

URL #6

Практически нет.....

guest: ммм
IP-штамп: frHvyGooYAnV2
гость

26.01.2007 13:09

URL #7

От липидов наверное лучше избавлятся осаждением белка ацетоном.

lirrok

01.02.2007 14:14

URL #8

Подскажите, пожалуйста, как высаживаются белки ацетоном или дайте ссылку. Спасибо.

guest: ммм
IP-штамп: frHvyGooYAnV2
гость

01.02.2007 14:34

URL #9

---Подскажите, пожалуйста, как высаживаются белки ацетоном или дайте ссылку. Спасибо.

Ну как,как? Если количественно весь белок высаживать, то охладить раствор с белком до 0^{0С, а ацетон градусов до -20 и медленно, в течении минутки, долить 4-5V ледяного ацетона в раствор белка, перемешивая, и на -20}0 - минимум на час, максимум - навсегда.

Время выдержки на -20 зависит от концентрации белка: если белка очень много то может хватить и 10', если мало, то суток обычно достаточно.

Внимание! В ацетоне практически нерастворимы неорганические соли, поэтому, если они присутствуют в высоких концентрация в исходном растворе белка, то выпадают в осадок вместе с белком и загрязняют его.

lirrok

01.02.2007 14:45

URL #10

Простите, если задаю глупые вопросы, т.к. в работе с белками - новичок. А что дольше делать? Мыть? В чём растворять после? Нужно ли сушить и т.д.?

lirrok

01.02.2007 14:46

URL #11

Опс
Не "дольше", а "дальше" :-)

Oleg Klychnikov
Постоянный участник
Moscow/Amsterdam->Leiden

01.02.2007 15:43

URL #12

(guest: ммм @ 01.02.2007 11:34)

Внимание! В ацетоне практически нерастворимы неорганические соли, поэтому, если они присутствуют в высоких концентрация в исходном растворе белка, то выпадают в осадок вместе с белком и загрязняют его.

4 объема ацетона к одному объему белка (80%)
на ночь на -20 и будет вам счастье
после этого фуговать эдак 10-20(30) мин, эдак 10-20 kg при 4С
отобрать супер, сушить - можно на спидваке, можно просто
открыть эппендорфу, если нужна активность после такого
издевательства, то сушить лучше на -20 с открытыми пробирками

и фсе
надо только иметь ввиду, что как любой метод преципитации,
ацетонирование имеет свои ограничения на количество белка
(если его мкг - то надо ко-преципитировать), на всякие разные
детергенты, если есть в буфере (белок просто может не сесть),
ну и всяки другие прелести,
так, что лучше всего пробовать на не очень дорогом для сердца
образце пилотное высаживание

только в этом топике - это офф-топ

Сообщение было отредактировано Oleg Klychnikov - 01.02.2007 15:54

Гость
IP-штамп: frvrUlzpAIyfs
гость

26.03.2008 18:57

URL #13

плиз, никогда не высаживайте сукрозный градиент ацетоном!

Guest
IP-штамп: frPanb9Lvzu1g
гость

27.03.2008 22:29

URL #14

Даже после солюбилизации SDS белок хорошо высаживается, если сначала проинкубировать 1 час на холоду с 10% ТХУ (в конечной концентрации), а затем разбавить равным объемом ацетона и оставит на ночь при -20 град, как здесь и советовали.

Гость
IP-штамп: frTX1Bt2UC3vE
гость

08.04.2008 18:04

URL #15

а мы промываем от ТХУ обычным охлажденным -20С этанолом

plotter
Постоянный участник
Стыдно признаваться о том, где живу...

29.01.2009 17:36

URL #16

А как отмыть осажденный тху осадок от тритона?

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

29.01.2009 18:11

URL #17

-А как отмыть осажденный тху осадок от тритона?
А почему вы думаете, что он там остается. Тритон вроде в ТХУ растворим.

Ну промойте метанолом, а затем метанолом с изобутанолом, вот как-то так.

Vadim Sharov
Постоянный участник
Россия

29.01.2009 22:29

URL #18

МММ, прав: отмойте раза два осадок тем же ТХУ, а само ТХУ холодным ацетоном.

david
Постоянный участник
Montreal, Canada

29.01.2009 22:39

URL #19

... Но лучше этих осаждений избегать. уж хлопотное это дело растворять осаздхенный белок. Я как то взял клетки с тарелки 10 см и выделял белок разным объемом лизис буфера. вестерн вышел одинаковый. С тех пор, я всегда сначала клетки соскребываю ПБС-ом, делаю спин даун, и полученный осадок растворяю в 50-100 микроллитров лизис буфера

plotter
Постоянный участник
Стыдно признаваться о том, где живу...

30.01.2009 11:59

URL #20

ммм, думаю так, потомучто осадок в сравнении с контролем, насыщеннее раза в 3. И pH другой сильно. И оно мылкое малость.
Но тут такая система, что и не такое бывает...

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

30.01.2009 14:07

URL #21

--ммм, думаю так, потомучто осадок в сравнении с контролем, насыщеннее раза в 3.

Гхм! А может это дезоксихолат или любые другие органические кислоты(или их соли).

--И pH другой сильно.
ЧТО!!! рН НЕ КИСЛЫЙ?!!
Значит вы мало льете кислоты(ТХУК) или у вас исходно сильно щелочная среда возможно имеет смысл подкислить ее перед осаждением уксусом или фосфорной кислотой. Тритон на рН не влияет и сам вроде в кислой среде растворим.

plotter
Постоянный участник
Стыдно признаваться о том, где живу...

30.01.2009 16:04

URL #22

Нет там солей (почти). Так, остатки незначительные, фрагменты микромолей.
Дезоксихолат не заказал ещё

Бум курить...

Гость
IP-штамп: fr7Ufi3qeYVAg
гость

27.03.2009 10:47

URL #23

Подскажите, пожалуйста!!! Я хочу выделить белок из эндотелиальных микрочастиц плазмы крови. Пробовала разрушать мембрану микрочастиц ультразвуком, а потом осадить ацетоном.После оставила на -20 на ночь, отцентрифугировала, высушила осадок, который потом растворила в буфере - но концентрация белка оказалась очень мала - что делать?

Гость
IP-штамп: frQVis2YTy5L2
гость

07.04.2009 22:35

URL #24

Подскажие, пожайлуста, что подойдет для мгновенной коагуляции белка для качественного анализа? Почему именно ТХУ так распространена для осаждения? Каков механизм ваимоействия ТХУ с беком?

Vadim Sharov
Постоянный участник
Россия

08.04.2009 03:11

URL #25

(Гость @ 07.04.2009 21:35)

Есть такой автор Остерман. Почитайте.

guest: plotter
IP-штамп: frlnAsDr.5x7A
гость

24.02.2011 18:07

URL #26

Нашел в тяговом шкафу около 2-х литров ТФУ (трифтор...) Как она работает в плане осаждения? Не пробовал кто?

Daemonarchestratygos
Постоянный участник

24.02.2011 18:25

URL #27

(guest: plotter @ 24.02.2011 16:07)

Нашел в тяговом шкафу около 2-х литров ТФУ (трифтор...) Как она работает в плане осаждения? Не пробовал кто?

Зависит от плана осаждения.

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

24.02.2011 18:50

URL #28

--Нашел в тяговом шкафу около 2-х литров ТФУ (трифтор...)

Я думаю вам их с радостью обменяют на 100кг ТХУК

Seleniti
IP-штамп: frdHXkjSmVgA.
гость

27.02.2012 22:10

URL #29

Подскажите пожалуйста,для чего после осаждения белка 5 % ТХУ, затем охлажденным 95 % ацетоном нужно осадок растворять в 0,5 N NaOH при нагревании?Для того,чтобы избавиться от ТХУ?Или для чего другого?

guest: ммм
IP-штамп: frQlBxj4iQSg.
гость

28.02.2012 06:27

URL #30

---Подскажите пожалуйста,для чего после осаждения белка 5 % ТХУ, затем охлажденным 95 % ацетоном нужно осадок растворять в 0,5 N NaOH при нагревании?Для того,чтобы избавиться от ТХУ?Или для чего другого?

1) В обсуждаемом протоколе, указанные вами процедуры отсутствуют.
2) От ТХУК вы не избавитесь, просто она перейдет в соль тихлорацетат натрия.

guest: валерий
IP-штамп: fr/FWcWysIOtM
гость

07.11.2012 13:02

URL #31

осадил белок тху, после чего не нашел N-конца. Не может ли тху алкилировать аминогруппы белка?

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

07.11.2012 15:15

URL #32

--осадил белок тху, после чего не нашел N-конца. Не может ли тху алкилировать аминогруппы белка?

Алкилировать не может, может ацилировать. Но вероятность низкая, возможно ваш белок модифицировался еще на стадии(ях) где-то до осаждения.

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.