Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
guest: Юлия IP-штамп: frOoJPTS6Yg9. гость |
С некоторых пор в лаборатории не идет научная часть ПЦР. Причем по всем направлениям разом. На наборах ИЛС анализы идут, а наукость на прймерах-прочем не идет. праймеры есть новые, есть проверенные, есть те, с которыми уже не первый год работаем, есть те, с которыми работали и заказали свежие. Простоколы новые, старые, отработанные, сто раз проверенные - всякие. На человеческие гены, на вирусы и бактерии, на днк-овые и рнк-овые, на 16s. Короче - ничего не амплифицируется. Вода MQ, пробовали и на ампулированной. Полимераза ферментосовская с родными буферами - открывали новые наборы. Пробовали на терциках и роторджине. Делали хотстарт на воске и на вазелине. Выделение на рибо-преп, хлороформно-солевым, с переосаждением. Кое-как начинает работать человеческая ДНК после выделения хлороформно-солевым с переосаждением на ацетате натрия. При это на кьюбите концентрация 9-17 мкг/мл. Другая человеческая ДНК с концентрацией 83-100 мкг/мл не работает. бактериально-вирусная 0,6-1,5 мкг/мл - тоже не работает. Все смотрим на агарозе и на акриламиде с планами на последующее секвенирвоание. Раньше, как уже писала, все работало и все секвенировали. Сейчас все повылетало. Вроде как все проверили. Спасите-помогите. пожалуйста. Что еще может быть??? |
ernesta88 Постоянный участник москва |
________ 4-е года назад у меня было такое с новыми наборами ферментас - вся полимераза была дохлой. Попробуйте взять другую полимеразу чтоб проверить в полимеразе ли дело. вот тут кажется даже тема была нащет некачественных наборов ферментас - вот имхо в ферментасполимеразе скорее всего и дело - поставьте с другой полимеразой, - приборы тут не при чем - вы ж сами говорите что на наборах ПЦР идет, а с этими нет. если вы из мск то купить полимеразу в сибэнзиме за копейки можно за 1 день. у еврогена тоже никогда не подводили полимеразы, |
Guest IP-штамп: frQCpGSFifrEU гость |
Если на наборе одного производителя/одной партии/в одном холодильнике полежавшем что-то не идет - это еще не "не идет пцр" вот когда 2-3 альтернативных набора не фурычат - это оно А зачем такие мучительные наборы? |
Guest IP-штамп: frDDJret4PE4A гость |
Ну если Вы кладёте 5-15мкл с такой концентраций - то ничего и не будет работать - раз бы в 10-100 развести. А вообще - картинки гелей нужно выкладывать - часто по гелю можно сказать, что не так. |
ernesta88 Постоянный участник москва |
|
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(guest: Юлия @ 30.06.2013 17:59) Уважаемые коллеги, прошу помощи. С некоторых пор в лаборатории не идет научная часть ПЦР. Причем по всем направлениям разом. На наборах ИЛС анализы идут, а наукость на прймерах-прочем не идет. праймеры есть новые, есть проверенные, есть те, с которыми уже не первый год работаем, есть те, с которыми работали и заказали свежие. Простоколы новые, старые, отработанные, сто раз проверенные - всякие. На человеческие гены, на вирусы и бактерии, на днк-овые и рнк-овые, на 16s. Короче - ничего не амплифицируется. Вода MQ, пробовали и на ампулированной. Полимераза ферментосовская с родными буферами - открывали новые наборы. Пробовали на терциках и роторджине. Делали хотстарт на воске и на вазелине. Выделение на рибо-преп, хлороформно-солевым, с переосаждением. Кое-как начинает работать человеческая ДНК после выделения хлороформно-солевым с переосаждением на ацетате натрия. При это на кьюбите концентрация 9-17 мкг/мл. Другая человеческая ДНК с концентрацией 83-100 мкг/мл не работает. бактериально-вирусная 0,6-1,5 мкг/мл - тоже не работает. Все смотрим на агарозе и на акриламиде с планами на последующее секвенирвоание. Раньше, как уже писала, все работало и все секвенировали. Сейчас все повылетало. Вроде как все проверили. Спасите-помогите. пожалуйста. Что еще может быть??? Делали хотстарт на воске и на вазелине |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(guest: Юлия @ 30.06.2013 17:59) Уважаемые коллеги, прошу помощи. С некоторых пор в лаборатории не идет научная часть ПЦР. Причем по всем направлениям разом. На наборах ИЛС анализы идут, а наукость на прймерах-прочем не идет. праймеры есть новые, есть проверенные, есть те, с которыми уже не первый год работаем, есть те, с которыми работали и заказали свежие. Простоколы новые, старые, отработанные, сто раз проверенные - всякие. На человеческие гены, на вирусы и бактерии, на днк-овые и рнк-овые, на 16с. Короче - ничего не амплифицируется. Вода МЯ, пробовали и на ампулированной. Полимераза ферментосовская с родными буферами - открывали новые наборы. Пробовали на терциках и роторджине. Делали хотстарт на воске и на вазелине. Выделение на рибо-преп, хлороформно-солевым, с переосаждением. Кое-как начинает работать человеческая ДНК после выделения хлороформно-солевым с переосаждением на ацетате натрия. При это на кьюбите концентрация 9-17 мкг/мл. Другая человеческая ДНК с концентрацией 83-100 мкг/мл не работает. бактериально-вирусная 0,6-1,5 мкг/мл - тоже не работает. Все смотрим на агарозе и на акриламиде с планами на последующее секвенирвоание. Раньше, как уже писала, все работало и все секвенировали. Сейчас все повылетало. Вроде как все проверили. Спасите-помогите. пожалуйста. Что еще может быть??? Пробовали на терциках и роторджине - включите в лабе кондишн на всякий случай |
Nett Постоянный участник |
Прогнать не идущее на интерлабе, если есть отдельно полимераза, либо одолжить у соседей какой-нибудь "не-ферментас" ps: терцик обычно мало чувствителен к +30С pps: А в чём прелесть ручного хотстарта, если ХС-полимераз существует море на любой вкус и карман? Сообщение было отредактировано Nett - 01.07.2013 12:47 |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Nett @ 01.07.2013 12:47) Задача номер 1: проверить фермент вместе с прилагающимся буфером. Прогнать не идущее на интерлабе, если есть отдельно полимераза, либо одолжить у соседей какой-нибудь "не-ферментас" пс: терцик обычно мало чувствителен к +30С ппс: А в чём прелесть ручного хотстарта, если ХС-полимераз существует море на любой вкус и карман? терцик обычно мало чувствителен к +30С - типа не работает и при +20 ? |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Nett @ 01.07.2013 12:47) Задача номер 1: проверить фермент вместе с прилагающимся буфером. Прогнать не идущее на интерлабе, если есть отдельно полимераза, либо одолжить у соседей какой-нибудь "не-ферментас" пс: терцик обычно мало чувствителен к +30С ппс: А в чём прелесть ручного хотстарта, если ХС-полимераз существует море на любой вкус и карман? ппс: А в чём прелесть ручного хотстарта, если ХС-полимераз существует море на любой вкус и карман? если "химические" полимеразы - то активируются при 95 град - тоест циклер должен уверенно держат 95 град 5-15 минут |
Nett Постоянный участник |
(Guest @ 01.07.2013 14:07) если "химические" полимеразы - то активируются при 95 град - тоест циклер должен уверенно держат 95 град 5-15 минут В чём проблема? За ротор не скажу, тот же терцик этому вроде бы обучен Парадоксально, но "конфорки" в жару работают так же, как и в +20 Если лаба делает поточные анализы (и наборы работают) - дело явно не в жаре |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Nett @ 01.07.2013 13:32) В чём проблема? За ротор не скажу, тот же терцик этому вроде бы обучен Парадоксально, но "конфорки" в жару работают так же, как и в +20 Если лаба делает поточные анализы (и наборы работают) - дело явно не в жаре На наборах ИЛС анализы идут, а наукость на прймерах-прочем не идет наборы обычно короткие фрагменты с добитыми праймерами - что такое "наукость" - не очен понятно - может 10 Кб |
Nett Постоянный участник |
Тем более "человечьи" в бактерио-вирусной лабе тоже обычно в виде контроля (явно не на 10 кБ) Ждём результатов от смены полимеразы, полагаю |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Nett @ 01.07.2013 14:29) Так у них "проверенные праймеры" Тем более "человечьи" в бактерио-вирусной лабе тоже обычно в виде контроля (явно не на 10 кБ) Ждём результатов от смены полимеразы, полагаю Все смотрим на агарозе и на акриламиде с планами на последующее секвенирвоание. Раньше, как уже писала, все работало и все секвенировали. сиквинировать чиловеческие контроли в санепидстанции - это круто |
Guest IP-штамп: frQCpGSFifrEU гость |
Углублённое изучение ОМЧ? |
Shenna |
Отвечу на всплывшие вопросы. Может, правда поможет. Это не санэпидстанция, разумеется. Одна из лабораторий НИИ Пастера в СПб. Анализы и наборы ИЛС - так как делаем анализы, направляемые к нам поликлиникой института. Поэтому и говорю, что с работой на наборах все в порядке. Наукость - ибо много у нас разных направлений. Секвенируем потихоньку некоторые гены/участки генов/участки геномов гепатита В, парвовируса В19, тифа, клепсиеллы, коклюша, паротита, лепотспиры. Плюс некоторые человеческие гены - BTK, IL-28B. В общем, разнообразие. 10 кб нету, в основном 250-1500 п.о. Полимеразу проверяли - ставили на ферментосе наборы илс - идут прекрасно. Ставили на илсовской полимеразе "наукость" - фиг, не идет. Вряд ли дело в приборах, так как при одновременной постановке на всех приборах одного и того же - дружно не срабатывает реакция. Вряд ли могли все сразу навернуться. Ручной хотстарт был сделан при обычной полимеразе, не хотстартовой. Температуры отжига подбирались - есть вполне проверенные и работавшие "системы", которые тоже внезапно не работают. Градиент делали, с разными вариациями шагов. На гелях либо чистота и тишина, соответственно выкладывать нечего. Либо легкий шмер (хотя в данном случае скорее флер) на первую треть дорожки - причем только на акриламиде. Есть предположение, что косяк стрясся с матрицами, все же. На форезе сама матрица вполне наличествует, на наборах, повторюсь, работают. Так как, действительно, наборы рассчитаны на коротенькие кусочки, а для "наукости" нужны подлиннее, причем на 250 некоторые матрицы работают, хоть и фиговенько, то размышляем на тему развалившейся ДНК. Странно, что развалились все разом. Да, они хранятся в одном холодильнике. Но, вроде как, холодильник не отключался, да и даже если отключался, ДНК при единичном отключении и при комнатной температуре не сдохнет. Вроде как. А в отпуск хотелось бы, но, увы до него еще 1-3 недели - у кого как. А пока надо как-то работать. |
R.J. Dio Постоянный участник |
|
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Shenna @ 02.07.2013 14:14) Большое спасибо за комментарии и советы. Отвечу на всплывшие вопросы. Может, правда поможет. Это не санэпидстанция, разумеется. Одна из лабораторий НИИ Пастера в СПб. Анализы и наборы ИЛС - так как делаем анализы, направляемые к нам поликлиникой института. Поэтому и говорю, что с работой на наборах все в порядке. Наукость - ибо много у нас разных направлений. Секвенируем потихоньку некоторые гены/участки генов/участки геномов гепатита В, парвовируса В19, тифа, клепсиеллы, коклюша, паротита, лепотспиры. Плюс некоторые человеческие гены - БТК, ИЛ-28Б. В общем, разнообразие. 10 кб нету, в основном 250-1500 п.о. Полимеразу проверяли - ставили на ферментосе наборы илс - идут прекрасно. Ставили на илсовской полимеразе "наукость" - фиг, не идет. Вряд ли дело в приборах, так как при одновременной постановке на всех приборах одного и того же - дружно не срабатывает реакция. Вряд ли могли все сразу навернуться. Ручной хотстарт был сделан при обычной полимеразе, не хотстартовой. Температуры отжига подбирались - есть вполне проверенные и работавшие "системы", которые тоже внезапно не работают. Градиент делали, с разными вариациями шагов. На гелях либо чистота и тишина, соответственно выкладывать нечего. Либо легкий шмер (хотя в данном случае скорее флер) на первую треть дорожки - причем только на акриламиде. Есть предположение, что косяк стрясся с матрицами, все же. На форезе сама матрица вполне наличествует, на наборах, повторюсь, работают. Так как, действительно, наборы рассчитаны на коротенькие кусочки, а для "наукости" нужны подлиннее, причем на 250 некоторые матрицы работают, хоть и фиговенько, то размышляем на тему развалившейся ДНК. Странно, что развалились все разом. Да, они хранятся в одном холодильнике. Но, вроде как, холодильник не отключался, да и даже если отключался, ДНК при единичном отключении и при комнатной температуре не сдохнет. Вроде как. А в отпуск хотелось бы, но, увы до него еще 1-3 недели - у кого как. А пока надо как-то работать. Странно, что развалились все разом. - магнитная буря над Питером |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(R.J. Dio @ 02.07.2013 14:20) возьмите СТАНДАРТНУЮ ДНК, выделенную НЕ вами, типа лямбды или НЕБовской Хела, поставьте ПЦр и посмотрите, идет или нет и на каких ферментах. Шаг второй- выкиньте неработающий фермент. Шаг третий- перейдите на Ваши матрицы и праймеры, вычлените неработающие комбинации. Какая к черту "наукость"- вот так неологизм, впервые слышу такое нелепое слово- так вот, какая к черту "наукость", если вы не может сделать работу над ошибками самостоятельно я обычно выбрасую все полимеразы и сразу Такару |
Nett Постоянный участник |
Юлия, здравствуйте Занесите пару-тройку лептоспир "на родину" на 5 этаж, посмотрим, что за беда стряслась с матрицей и "человечины" на пять реакций тоже можно, если есть Сообщение было отредактировано Nett - 02.07.2013 14:51 |
R.J. Dio Постоянный участник |
(Guest @ 02.07.2013 15:48) я обычно выбрасую все полимеразы и сразу Такару ну, у каждого свои тараканы |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(R.J. Dio @ 03.07.2013 10:58) евроген далеко |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(R.J. Dio @ 03.07.2013 10:58) |
Guest IP-штамп: frWKcU.b0hdB2 гость |
|
Guest IP-штамп: frQCpGSFifrEU гость |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Раз просите помощи, примите от меня работающую полимеразу в составе мастермикса. |
Guest IP-штамп: frWKcU.b0hdB2 гость |
(R.J. Dio @ 02.07.2013 14:20) возьмите СТАНДАРТНУЮ ДНК, выделенную НЕ вами, типа лямбды или NEBовской Hela, поставьте ПЦр и посмотрите, идет или нет и на каких ферментах. Шаг второй- выкиньте неработающий фермент. Шаг третий- перейдите на Ваши матрицы и праймеры, вычлените неработающие комбинации. Какая к черту "наукость"- вот так неологизм, впервые слышу такое нелепое слово- так вот, какая к черту "наукость", если вы не может сделать работу над ошибками самостоятельно Это по олбански. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Guest @ 03.07.2013 22:50) Это был я. |
Guest IP-штамп: frQCpGSFifrEU гость |
|
Guest IP-штамп: frQCpGSFifrEU гость |
|
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Guest @ 03.07.2013 22:48) ну не знаю - в 1993 у меня ферментас 1000 бп делал за 15 минут - 2.5 юнита на 20 миклов |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(-Ъ- @ 03.07.2013 20:51) У вас не работает полимераза. Ферментас силен не полимеразами, а рестриктазами. Раз просите помощи, примите от меня работающую полимеразу в составе мастермикса. насколко помню первую ПЦР в СССР поставили в Питере , а не в Москве |
R.J. Dio Постоянный участник |
(Guest @ 04.07.2013 09:44) ну не знаю - в 1993 у меня ферментас 1000 бп делал за 15 минут - 2.5 юнита на 20 миклов в 1993 Ферментас (НПО Фермент) еще на СНГ работал, а потом уже решил, что он Европа, и можно в Россию сливать всякое говно Ну вот, не по логике, а вопреки , в глазах всего мира мы стали другие. И даже в носу не при всех ковыряем, И даже толчки за собою смываем. Практически где-то - уже мы Европа, Но где это - где-то - не знает никто тут... |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Guest @ 04.07.2013 09:44) ну не знаю - в 1993 у меня ферментас 1000 бп делал за 15 минут - 2.5 юнита на 20 миклов А чего у Кабоева не брал? Сообщение было отредактировано -Ъ- - 04.07.2013 13:32 |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Guest @ 04.07.2013 09:53) насколко помню первую ПЦР в СССР поставили в Питере , а не в Москве Ну сколько можно!? |
R.J. Dio Постоянный участник |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(R.J. Dio @ 04.07.2013 14:47) Гатчина, ЛИЯФ им. Константинова. А Третьяков - тот самый жирный тролл молбиол форума. |
Yuri K IP-штамп: frO84jFrTPiQA гость |
В ПЦР лаборатории все должно быть разаликвочено на порции, которые используются по одной, остальное в заморозке. Такая система позволяет как контролировать возможную контаминацию, так и легко справляться с периодическим издыханием чего-то. При этом вы никогда не расходуюте до последней аликвоты очередной лот, скажем, праймеров, пока не убедитесь, что новый лот праймеров тоже работает.
|
Guest IP-штамп: frQCpGSFifrEU гость |
Сдается мне, студент отправлен на каникулы Да, про 2.5 юнита - и без неспецифики? |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Guest @ 09.07.2013 19:00) Хыхы. То лаборатория, а то интерлаб напополам с "намукостью" Сдается мне, студент отправлен на каникулы Да, про 2.5 юнита - и без неспецифики? Можно ставить и с 5 юнитами, если не жалко. Вся "наукость" в том как утихомирить прорву фермента в маленьком объеме, чтоб было без неожиданностей и тянул хоть 100 циклов в присутствии ингибиторов. Ну если они они горбатые - другое дело... |
КсюшаНСК |
Как только темперетура в комнате приблизилась к 30 градусам наши стандартные ПЦР перестали работать. ИЛС-совские работали, с ихними ферментами или хотстарполимеразами все отлично работало. Жара спала и все опять пошло. |
R.J. Dio Постоянный участник |
Сообщение было отредактировано R.J. Dio - 04.08.2013 10:00 |
Guest IP-штамп: frQCpGSFifrEU гость |
|
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(R.J. Dio @ 04.08.2013 09:59) Тут и скачки влажности, и непонятный режим внутри морозильника с бесконечным намораживанием- лето, одно слово говорю же - магнитные бури |
Guest IP-штамп: frQCpGSFifrEU гость |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Guest @ 05.08.2013 08:55) Правильно, это бури, поля, леса. И магний ведет себя неадекватно (по версии моего знакомого с барабашками в каждом углу и в голове тоже). |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Guest @ 05.08.2013 07:56) В жаркую погоду имеют преимущество автомобили с кондиционером. По данным ADAC, температура в салоне должна поддерживаться на уровне 21 - 23 градусов. Многие автомобилисты понижают температуру ниже 20 градусов, однако чрезмерное охлаждение воздуха увеличивает расход топлива и выбросы углекислого газа. Разница между внутренней и наружной температурой не должна превышать шести градусов. Кроме того, в жаркие дни рекомендуется хорошо проветрить до поездки нагретый автомобиль, открыв двери. Из-за сильной жары снова возникли проблемы на немецких автомагистралях. На шоссе A3 между Дьез и Лимбург образовалось вздутие асфальта. Об этом сообщила дорожная полиция в пятницу, 2 августа. На повреждённом участке движение было ограничено одной полосой в связи с ремонтными работами образовалась большая пробка. По данным полиции, в четверг, 1 августа, на шоссе A1 недалеко от Хетцерат в направлении Саарбрюккен из-за высокой температуры возникло повреждение дорожного полотна. В настоящее время в пострадавших районах движение восстановлено. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
|
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(-Ъ- @ 06.08.2013 12:36) обманывать нехорошо |
Guest IP-штамп: frpe75NzPynak гость |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |