Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Вопрос о пцр real-time
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Angarad




 прочитанное сообщение 05.08.2016 10:00     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Здравствуйте!Я молодой специалист,с реал-таймом работаю всего ничего,опыта пока маловато,поэтому очень нуждаюсь в совете)))Занимаюсь фармакогенетическим тестированием,пользуюсь для этого готовыми наборами от Еврогена,прибор фирмы BIO-RAD.В последнее время часто вижу такую картину на готовых графиках: недалеко от 10 цикла(всего их 50) график стремительно и основательно так "улетает" вниз за 0,откуда потом начинает расти,потом выравнивается,далее все стандартно(т.е. рост кривых начинается где-то на цикле 20-25).Образуется в итоге этакая "яма",из-за которой прибор начинает криво оценивать результаты(проверено.Если данный участок вырезать-получаются нормальные графики).Ужас в том,что такие "ямы" подчас возникают с 10 по 20 цикл,в некоторых случаях образуются две "ямы":одна с 1 по 10,другая- с 10 по 20.Лунки разные.Образцы ставятся в дублях,причем "провалиться" может как одна пробирка из дубля,так и обе.Реактивы одной фирмы,но такую картину вижу на разных ее наборах."Ямы" наблюдаю и в пробирках с образцами,и в контроле без матрицы.Раньше такого вроде не было.Не могу понять-прибор с ума сходит,реактивы плохие,я косорукая или все вместе?
Участник оффлайн! NMR-guy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 05.08.2016 13:26     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Тут иногда тусуется один Х-перд с Еврогена - вот пусть и отвечает что не так в его китах или в Вашем приборе.

Гель есть на чем прогнать реакции? Если есть - грузите на гель и вешайте сюда картинку геля.
Участник оффлайн! Nett
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 05.08.2016 14:19     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

А что там гель даст, если в итоге кривые растут?
Прогоните на приборе другой набор или свои праймеры, если есть, проблемы прибора тоже не исключены.
Если ЕГ вам разработал уникальную систему - это вопрос к службе поддержки компании.

50 циклов - жесть какая-то.

Сообщение было отредактировано Nett - 05.08.2016 14:20
Участник оффлайн! kb1
Участник



 прочитанное сообщение 05.08.2016 14:22     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Похоже дело в приборе (возможно в настройках, а может быть в комнате слишком жарко). Наборы могут работать (лучше или хуже) или не работать, а рисовать картинки описанные Вами - это вряд ли.

Мало информации. Где картинки? Что за набор? какие условия ПЦР?
Участник оффлайн! kblag
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 05.08.2016 20:26     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Картинки в студию smile.gif
Участник оффлайн! Angarad




 прочитанное сообщение 05.08.2016 22:00     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Геля у нас нет,праймеров своих,к сожалению,тоже(((Наборы ГенЧек от Еврогена для детектирования SNP(генотипирование вообщем).Красители,используемые в данных наборах-FAM и HEX.Программу ввожу,как рекомендует Евроген(мне она,честно скажу,не нравится,но выбора нет).
Протокол проведения пцр по Еврогену:
1. 95 градусов, 3 минуты(первый цикл)
2. 95 градусов, 10 секунд
3. 60 градусов, 30 секунд(здесь же замер флюоресценции)
Пункты 2 и 3 повторяются 49 раз(по сути,1 цикл состоит из двух пунктов-пункта 2 и пункта 3).Рекомендации к проведению анализа от Евроген:установить циклы для анализа с 10 по 50(что меня в случае "ям" с 10 по 20 цикл,ясно дело,не устраивает).
Добавлю: чаще всего "проваливается" FAM,HEX реже,но бывает.Также наблюдала и в образцах,и в контроле без матрицы(лунки разные) такую картину:с первого цикла один из красителей куда-то под потолок и далее на одном уровне до самого конца(не падает и не поднимается).Где-то тут на форуме уже был такой график(с красителем с первого цикла под потолок),почитала литературу-называют причину либо высокий изначальный уровень флюоресценции в образце,либо неправильную калибровку прибора.Здесь все,вообщем,более-менее ясно,а что за ерунда с "ямами",тоже калибровка,что ли?Жара тоже может быть,нет кондиционера и ледогенератора,только холодильники,а сейчас лето,сами понимаете(((Картинки постараюсь предоставить.
Участник оффлайн! NMR-guy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 05.08.2016 23:11     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

Откалибруйте высоту пробирок в Вашем приборе под те, в которых раскапан кит. Чтобы они плотно подтыкались крышкой сверху, но при этом не сминались вместе с пробирками (особенно - если их мало). Также чрезвычайно важно после окончательной "сборки" мастермикса с образцами и вортексирования их СБРАСЫВАТЬ (ОТКРУЧИВАТЬ КОРОТКО, СПИН-ДАУН) перед установкой в гнезда термоциклера и аккуратного, но герметичного прижима нагреваемой крышкой.

Ваши чудеса могут объясняться мелкими капельками на крышках и стенках, которые теряют стабильность от конденсатата и бухаются в основной раствор, чем ОБРАТНО резко снижают концентрацию красителя. А так как в начале, первые 3 минуты при 95С вода испарялась БЕЗ КРАСИТЕЛЯ, дополняя конденсат на стенках, то кажущийся ноль красителя на первом цикле был искусственно завышен. Потому на фоне такого нуля после случайного обваливания капелек обратно в раствор. Хотя, такого рода процессы должны больше быть похожи не на "яму", а на обрыв и скачки, с плавным уползанием сигнала краски вверх и резким обрывом вниз. Яма то есть возникает резко вниз, потом плавно восстанавливается.

1. Откручивайте (сбрасывайте) закрытый планшет/стрипы перед установкой в термоблок в бакетном роторе. Переносите сброшенный планшет в термоблок медленно и аккуратно, без встряхиваний.
2. Проверьте, оптимально ли прижаты пробки пробирок в термоблоке в ходе реакции, при необходимости перекалибруйте высоту прижима.
3. Попробуйте после выполнения пп.1 и 2 изменить первый шаг (денатурацию при 95С) на 30с при 94С, остальные вторые периоды тоже снизьте температуру до 94С. Посмотрите, будет ли разница.
Участник оффлайн! Nett
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 06.08.2016 03:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

Либо проверяйте набор на другом приборе, либо прибор другим китом. Нарушений транспортировки-хранения кита не было?
Либо сразу топайте ногами на еврогеновцев, пусть предоставят какой-нибудь стрип с другой мишенью на проверку - в крайнем случае.
Участник оффлайн! Angarad




 прочитанное сообщение 08.08.2016 08:35     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

Другого прибора у меня нет,к сожалению.только этот(((Стрипы каждый раз откручиваю перед постановкой в амплификатор,когда ставлю в прибор,всегда проверяю,нет ли чего на стенках.А высоту крышки как поменять можно?

Обещанные картинки.Первые две нормальный график до анализа(1 картинка) и после анализа с 10 по 50(2 картинка).Третья и четвертая-моя проблема до(3 картинка) и после анализа с 10 по 50(4 картинка).Пятая-рост HEX с первого цикла(не падает и не поднимается вплоть до самого конца),потом идет рост FAM.Если задать этому образцу анализ с 10 по 50-картинка будет как в норме.Ситуацию 5 часто вижу в пробирках без матрицы.Картинки 1,2,5-один и тот же пациент,только в дубле.Сами видите-один пациент,но две разные картины в графиках.Все приведенные графики получены в одной постановке.

Картинки:
________1____50.gif - кликните, чтобы открыть увеличенную картинку
________1____50.gif — (385.95к)   

________10____50.gif - кликните, чтобы открыть увеличенную картинку
________10____50.gif — (386.49к)   

___________1____50.gif - кликните, чтобы открыть увеличенную картинку
___________1____50.gif — (390.74к)   

___________10____50.gif - кликните, чтобы открыть увеличенную картинку
___________10____50.gif — (388.27к)   

____________.gif - кликните, чтобы открыть увеличенную картинку
____________.gif — (389.6к)   

____________.gif - кликните, чтобы открыть увеличенную картинку
____________.gif — (389.6к)   

Участник оффлайн! kblag
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.08.2016 09:45     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

Спасибо за картинки, но с ними всё понятно - нужно обрезать первые 10 циклов для всех образцов и проблем не будет. Или у Вас есть образцы, которые проходят до 10 цикла?

Интереснее посмотреть на :
Ужас в том,что такие "ямы" подчас возникают с 10 по 20 цикл,в некоторых случаях образуются две "ямы":одна с 1 по 10,другая- с 10 по 20.
Участник оффлайн! NMR-guy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 08.08.2016 09:49     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

> А высоту крышки как поменять можно?

Должен быть или уплотнительный винт или режим программы в котором прибор сам подбирает высоту зажатия пробирок. Так как у плашек и стрипов высота может быть разной - нужно обязательно разобраться в вопросе. Возможно Ваш прибор автоматически ее определяет и калибрует ее каждый новый раз как Вы туда что-то ставите и проблемы с этим нет.

Если дело не в крышках - то какая-то таинственная хрень получается. Если бы дело было в испарении, то графики бы увеличивали бы ступенчато сигнал каждый цикл (из-за ступенчатого роста концентрации флуорофора). Тут же у Вас вообще два каких-то процесса конкурируют в пробирке. Ждем коммента главного еврогеновского Х-Перда по ихним китам, он тут всем и всегда предлагает что сделать и что у них купить, так что скоро вмешается комментами, думаю.
Участник оффлайн! kblag
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.08.2016 10:17     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

В BioRad CFX крышка сама прижимается до нужной высоты для плашек и стрипов.
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.08.2016 10:58     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

Поиграйтесь с настройками базовой линии или порога, не помню - может помочь.
Либо считывать лунки не с нуля начинайте, как на некоторых прогонах.

Вообще странно - у вас очень низкий сигнал. Я с сайбром работаю - так он 4000-6000 ЦФУ дает разницу между базовой линией и плато у кривой (тот же прибор). Мне кажется, в вашем случае можно сказать, что ПЦР просто не идет...

Сообщение было отредактировано ksm - 08.08.2016 11:12
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 08.08.2016 11:41     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

(Angarad @ 05.08.2016 23:00)
Ссылка на исходное сообщение  Геля у нас нет,праймеров своих,к сожалению,тоже(((Наборы ГенЧек от Еврогена для детектирования SNP(генотипирование вообщем).Красители,используемые в данных наборах-FAM и HEX.

Независимо от того какие мутации обнаруживаются, наследственные или соматические, использованный метод (зонды или аллельспецифические праймеры) "генотипирования вообщем" неудачный, плохо освоенный разработчиками (не умеют выбирать зонды tongue.gif ).
Но umnik.gif , с другой стороны, этот рельеф (ямки, бугорочки) до 20-25 цикл. в пределах 100 rfu не страшно, если далее позитивный сигнал взлетает до 1000 и выше, а не еле-еле доползает до 200-300. На сайте Еврогена ни слова про этот набор, хорошо бы получить хоть какую-то минимальную инфу про метод - очень хочется помочь девушке. smile.gif
Остальные советы там про форез, высоту пробирок, крышку прибора и т. п. - ботва, дилетанские советы frown.gif .

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): NMR-guy
Участник оффлайн! kblag
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.08.2016 11:41     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

(ksm @ 08.08.2016 11:58)
Ссылка на исходное сообщение  
Вообще странно - у вас очень низкий сигнал. Я с сайбром работаю - так он 4000-6000 ЦФУ дает разницу между базовой линией и плато у кривой (тот же прибор). Мне кажется, в вашем случае можно сказать, что ПЦР просто не идет...


Сайбр сигнал больше даёт.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 08.08.2016 11:47     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

(ksm @ 08.08.2016 11:58)
Ссылка на исходное сообщение  Поиграйтесь с настройками базовой линии или порога, не помню - может помочь.
Либо считывать лунки не с нуля начинайте, как на некоторых прогонах.

Вообще странно - у вас очень низкий сигнал. Я с сайбром работаю - так он 4000-6000 ЦФУ дает разницу между базовой линией и плато у кривой (тот же прибор). Мне кажется, в вашем случае можно сказать, что ПЦР просто не идет...

По сравнению с сайбром и значениями 6000, конечно, реакция не идет можно сказать.
Но и такие высокие значения RFU тоже как говорят на востоке "очень хорошо тоже не хорошо" - потеряете чувствительность из-за частичного ингибирования реакции сайбром.
Это небольшой офтоп, пардон.

Всего благодарностей: 2Поблагодарили (2): kblag, NMR-guy
Участник оффлайн! Angarad




 прочитанное сообщение 08.08.2016 13:41     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

Картинки с двойным провалом попробую найти,но не обещаю,могли не сохраниться.Резка помогает,но только для графиков.По части аллельной дискриминации...вообщем,там кошмар.Судите сами-на графике 3 явная гомозигота.Однако прибор на голубом глазу утверждает-гетерозигота(это по ОЕФ).И будет утверждать так,до тех пор пока не вырежем саму яму(а это 20 цикл,а не 10Й).Тогда скажет-да, гомозигота по ОЕФ.Но при этом повредятся другие результаты-начнет говорить,что там дескать,гетерозиготы(хотя до резки утверждал,что гомозиготы) или вообще ноль,или гомозигота по мутантному аллелю(вообщем,чущь всякую несет).Графики при этом будут,как на гомозиготу по дикому типу(что до,что после резки).Это подтверждает и аллельная дискриминация по CQ-там все четко,гомозигота по дикому типу в образцах,без матрицы-это без матрицы и тд.Вообщем,мне приходится с каждой кривой нянькаться индивидуально.А теперь представьте-спорный образец(редко,но бывает),по графику непонятно,а прибор ерунду всякую пишет,смотря, где провал произошел.Недавно вот график непонятный был сам по себе,так еще и с провалом.Режу-то одно на картинке,то другое.По аллелю смотрю-прибор то пятое,то десятое.И не переставишь реакцию-реагент кончился.А когда он впервые провал нарисовал(было это образце без матрицы),у меня чуть инфаркт не случился,думала,контаминация в лаборатории.Потом порезала график,увидела привычный зигзаг,увидела,что сигнал нулевой и успокоилась.Вот только из-за этой аллельно-графической чуши,я и хочу понять,что не так.Иначе как мне результат выдавать?А с линией пыталась играться(и с нормализацией тоже)-там не намного лучше,даже хуже зачастую получается.Могли бы помочь кривые плавления,но не выдает их наш прибор почему-то(((
Участник оффлайн! Noom
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.08.2016 13:57     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

Любой просмотр кривых амплификации начинайте с просмотра кривой без вычета базовой линии. Тогда прекрасно видно где у вас провалы. Затем выставляйте руками диапазон циклов для вычисления базовой линии для проблемной кривой. Подавляющее большинство ваших проблем после этого исчезнет. Вы уверены что ваш пластик подходит для CFX? Возможны варианты когда заминается крышка и в итоге у вас идет испарение реакционной смеси. Если есть подозрение что пластик "течет" а возможности поменять его нет - закапывайте минеральное масло.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 08.08.2016 14:21     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

CFX 96 принимает средне- и низкопрофильный пластик одинаково успешно. Крышка у него такая "умная", выбирает что ему по нраву.А для равномерного распределения давления (это в случае единичных пробирок или одного стрипа) следует устанавливать пустые (подпирающие) аналогичные стрипы в крайние позиции. Это обязательное правило для всех термоциклеров, а не только для БиоРада.
Высокопрофильный пластик сейчас поискать надо, может его сейчас и не производят.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 08.08.2016 14:23     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

Angarad, а что говорят в Еврогене или там все ушли на фронт?
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 08.08.2016 14:24     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

kblag, что там использовано, ТакМаны или праймеры?

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): NMR-guy
Участник оффлайн! kblag
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.08.2016 14:27     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

Судите сами-на графике 3 явная гомозигота

график 3 это последний?
В нём после обрезки циклов канал HEX не выравнивается?

Могли бы помочь кривые плавления,но не выдает их наш прибор почему-то(((

в наборах ТакМаны без асимметрии - плавить нечего.
Участник оффлайн! kblag
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.08.2016 14:57     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #23 множественное цитирование

Про график три понял - это, видимо, самый кривой. Он же исправился после обрезки? Или нет?
В инструкции к набору есть алгоритм обработки и что там пишут про обрезку?
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 08.08.2016 17:39     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #24 множественное цитирование

Бомбите эту компанию, а не Евроген.
http://nomotech.ru/products.html
http://nomotech.ru/DAOSS.html
Участник оффлайн! Nett
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.08.2016 18:19     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #25 множественное цитирование

А у Вас контроли в наборе предусмотрены? Как с ними графики выглядят?
Из представленных графиков, где провал после 20 цикла - реакция не идёт.
Участник оффлайн! Angarad




 прочитанное сообщение 08.08.2016 19:37     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #26 множественное цитирование

Евроген на меня вышел,буду разбираться с ними,что не так.Минерального масла нет.Контроли предусмотрены,могу,в принципе,поставить(давно не ставила,ради экономии китов.Тем более раньше они(контроли) всегда нормально получались).Про алгоритм обработки уже писала-рекомендовано выбирать для анализа с 10 по 50 цикл.Это решает проблему,когда провал происходит до 10 цикла,а вот после 10...Суть в том,что обрезав график согласно рекомендациям я получаю внешне нормальный график,но по аллельной дискриминации по ОЕФ прибор все равно(в случае провала после 10 цикла) оценивает результат неверно(может гомозиготу гетерозиготой обозвать,к примеру).Вот если обрезать конкретно эту кривую до 18 цикла,тогда да,по ОЕФ все выходит правильно.В случае четких графиков,я могу,в принципе не заморачиваться с аллельной дискриминацией,но вот когда возникают сомнения,такое поведение прибора сбивает с толку и только добавляет сумятицу.Поэтому хотелось бы найти причину и устранить ее,дабы иметь возможность спокойно оценивать результаты.
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.08.2016 23:38     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #27 множественное цитирование

(-Ъ- @ 08.08.2016 12:47)
Ссылка на исходное сообщение  По сравнению с сайбром и значениями 6000, конечно, реакция не идет можно сказать.
Но и такие высокие значения RFU тоже как говорят на востоке "очень хорошо тоже не хорошо" - потеряете чувствительность из-за частичного ингибирования реакции сайбром.
Это небольшой офтоп, пардон.


Спасибо!
Буду знать!
В принципе, у меня обычно эффективность ПЦР близка к 100% по стандартным кривым, а там где нет - я поправку ввожу. Для относительной нормировки экспрессии это не играет роли, как я понял.
А вообще Сайбр-мастер микс у меня от всеми так любимого Еврогена, но я в принципе им доволен - хорошо воспроизводится в разных экспериментах. Родной биорадовский несмотря на заверения о большом количестве циклов разморозки/заморозки, после каждого очередного оттаивания снижал эффективность на 20% примерно)))
Guest
IP-штамп: frOb1CBSDvrOc
гость



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  09.08.2016 00:12     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #28 множественное цитирование

horioshay ideya mo uvy, nenauchnaya
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 09.08.2016 02:20     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #29 множественное цитирование

(ksm @ 08.08.2016 21:38)
Ссылка на исходное сообщение  Родной биорадовский несмотря на заверения о большом количестве циклов разморозки/заморозки, после каждого очередного оттаивания снижал эффективность на 20% примерно)))

что значит снижал "эффективность" на 20%? вы же не проверяете эффективность пцр для каждой пары праймеров после каждой разморозки микса. или что вы опдразумеваете под эффективносстью?
я работаю на биорадовских миксах, iTaq™ Universal SYBR® Green Supermix,нет никаких проблем. три дня, три разморозки, три повтора пцр для одних и тех же образцов- Ct варьирует в диапазоне меньше 1 цикл
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 09.08.2016 09:17     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #30 множественное цитирование

Ну, построил калибровочные кривые до и после разморозки.
Т.е. раститровал ДНК, поставил ПЦР на миксе с 1-й разморозки, определил эффективность, скажем, 109%; заморозил мастер микс. Разморозил. Поставил с теми же ДНК-пробами и с размороженным мастер миксом новый ПЦР с теми же праймерами - получил 92%.
Получается, что да, когда есть место в плашке - проверяю.

Сообщение было отредактировано ksm - 09.08.2016 09:41
Участник оффлайн! kblag
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 09.08.2016 11:13     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #31 множественное цитирование

109% - 92% не очень показательно.
Вот если с 92% до 72% - то это интересней.
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 09.08.2016 11:56     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #32 множественное цитирование

Ну с 92 до 72% это уж слишком! даже для Биорада!

Сообщение было отредактировано ksm - 09.08.2016 15:25
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 09.08.2016 11:59     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #33 множественное цитирование

(-Ъ- @ 08.08.2016 15:24)
Ссылка на исходное сообщение  kblag, что там использовано, ТакМаны или праймеры?

Ну так что?
Участник оффлайн! kblag
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 09.08.2016 12:56     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #34 множественное цитирование

(-Ъ- @ 09.08.2016 12:59)
Ссылка на исходное сообщение  Ну так что?

Выше писал -
в наборах ТакМаны
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 09.08.2016 13:24     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #35 множественное цитирование

(ksm @ 09.08.2016 07:17)
Ссылка на исходное сообщение  Ну, построил калибровочные кривые до и после разморозки.
Т.е. раститровал ДНК, поставил ПЦР на миксе с 1-й разморозки, определил эффективность, скажем, 109%; заморозил мастер микс. Разморозил. Поставил с теми же ДНК-пробами и с размороженным мастер миксом новый ПЦР с теми же праймерами - получил 92%.
Получается, что да, когда есть место в плашке - проверяю.

а что за пробы? сколько там матрицы? вы не думаете, что пробы и праймеры тоже замораживаются-размораживаются и могут подваливаться?
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 09.08.2016 13:40     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #36 множественное цитирование

(kblag @ 09.08.2016 13:56)
Ссылка на исходное сообщение  Выше писал -

Простые ТакМаны так себя не ведут. no.gif
Афтар не заморачивается что там за зонды, ему это как бы не надо знать. Но пользователю важно чтобы работая по Инструкции получались интерпретируемые результаты, без всяких творческих выкрутасов с "обрезанием начальных циклов" и т.д.
Не могут нормальные ТакМаны, отличающиеся всего навсего одним нуклеотидом, выдавать такой рельеф с ямками. Высокий фон и низкое свечение - частое явление.
Вы что-то там перемудрили, kblag. Это неудачная система для конкретного СНПа.
Я бы переделал...

Извините, забыл спрсить, а что есть Такманы без асимметрии? Неужели доморощенный термин? Или я сильно отстаю от новинок?

Сообщение было отредактировано -Ъ- - 09.08.2016 13:45

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): NMR-guy
Участник оффлайн! kblag
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 09.08.2016 14:03     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #37 множественное цитирование

(-Ъ- @ 09.08.2016 14:40)
Ссылка на исходное сообщение  Такманы без асимметрии?

это я к вопросу о плавлении - имею ввиду, что ПЦР не асимметричная и плавить там зонды не получится
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 09.08.2016 21:11     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #38 множественное цитирование

(ship @ 09.08.2016 14:24)
Ссылка на исходное сообщение  а что за пробы? сколько там матрицы? вы не думаете, что пробы и праймеры тоже замораживаются-размораживаются и могут подваливаться?


ну, дцДНК раститровка для калибровки. Она и праймеры не размораживались/замораживались, а жили во льду все это время. кроме того, ДНК устойчивее к разморозке/заморозке в отличие от активности белков.
в любом случае, спешу вас заверить, что виноват ТОЧНО не я!
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 10.08.2016 11:02     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #39 множественное цитирование

(Angarad @ 08.08.2016 20:37)
Ссылка на исходное сообщение  Евроген на меня вышел,буду разбираться с ними,что не так.

Ждем-с. Завершите достойно свою тему!

Сообщение было отредактировано -Ъ- - 10.08.2016 14:42
Участник оффлайн! Ivalex
Участник



 прочитанное сообщение 11.08.2016 11:50     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #40 множественное цитирование

Тема кстати больная. У меня также стоит Bio-Rad (CFX96) и страдает от похожей болезни.
Реактивы еврогеновские (qPCRmix HS), работаю не с SNP, а обычным RT-PCR

Что мне удалось выяснить "опытным" путем:
1) "Провал" - хотя я бы скорее назвал это "наклоном", ведь если график визуально повернуть на n градусов, то он выглядеть будет нормально - напрямую связан с уровнем сигнала. Подобные явления встречались только на сильно разбавленном SYBR (или прошедшим много циклов заморозки-разморозки) и Taq-зондах. Это не связано с Еврогеном (по крайней мере напрямую) - зонды от Синтола также страдают от "упадочной болезни". Эту мысль подтверждает эксперимент с планшетами с пленками (Microseal B Bio-rad) и пробирками с "оптически чистыми" крышками (не Bio-rad). Через "оптически чистые" крышки сигнал идет чуть хуже и количество "наклонов" на эксперимент выше.

2) Обрезка циклов и выпрямление базовой линии своими руками (как тут советовали), конечно, решает проблему, но как уже сказал выше -Ъ- - хочется достоверных результатов без явно лишних маханий руками.

3) Проблема кстати не была видна на приборе Rotor-gene 3000, так что ИМХО - это проблема ПО.

4) Временное решение проблемы - это адекватное изменение количества зондов. Попробуйте двойные разведения.

Можно еще попытаться поставить детекцию не с первого цикла, а с пятого-седьмого. Проблема может быть также связана с "глубоким нулем" на первых циклах

Сообщение было отредактировано Ivalex - 11.08.2016 11:51
Участник оффлайн! kblag
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 11.08.2016 12:47     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #41 множественное цитирование

Все эти начальные провалы, на мой взгляд - это глобальная проблема качества отечественного синтеза зондов - точнее его отсутствие.
Участник оффлайн! avial
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 14.08.2016 21:18     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #42 множественное цитирование

Это провал на обработанных данных, а на сырых там должна быть ступенька, из-за общего невысокого подъема кривых получается такая картина, когда софт неправильно базовую линию обсчитывает и загибает вниз все графики.
У биорада вообще много проблем именно с математикой, к сожалению. Хотя околомедицинские лаборатории его очень любят за простоту.
Участник оффлайн! NMR-guy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 14.08.2016 23:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #43 множественное цитирование

Когда нормально сделана химия никакая математика её испортить не способна. А когда отношение измеряемого сигнала к базовому шуму такое какое есть - то конечно во всём сразу "математика" виновата.
Участник оффлайн! avial
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 14.08.2016 23:56     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #44 множественное цитирование

Угу, расскажи про нормальную химию краевым эффектам того же биорада, когда крайние лунки без их костыля в виде бортика просто тупо выпариваются. Расскажи кросс-засветке ДТ-96, когда высокий сигнал по фаму дает кривую амплификации в хексе, хотя самого хекса в смеси нет вообще - вот тут особенно ценен совет про высокий сигнал/шум.
Именно поэтому серьезные фирмы валидируют тест-системы исключительно под свои приборы, а не пытаются "нормальной химией" исправить все косяки чужих.
Участник оффлайн! NMR-guy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 15.08.2016 17:03     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #45 множественное цитирование

Товарищъ топикстареръ не докладывает ни о каких "краевых эфффектах" биорада. Он докладывает о случайных по позициям в плашке луночных косяках (которые даже иногда контроли портят). В которых виновата явно не "математика".

Если хекса нет вообще - то зачем его включать? Чтобы написать очередную подстоенную гадость про нормальный прибор? Матрицу дискриминаций красителей при калибровке прибора никто не отменял. "Рассказать кроссзасветке" можно в любом криво откалиброванном амплификаторе, поскольку кроссзасветка - это свойство не прибора, а перекрывающихся спектров флуоресценции красителей... Первый-второй курс института. Дрейфуют спектры? - Перекалибровывать надо чаще, а не экономить на заварке. wink.gif
Участник оффлайн! avial
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 16.08.2016 01:07     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #46 множественное цитирование

Правда? Я должен перекалибровывать только что распакованный прибор? А почему я на аби тогда такой хренью не страдаю?

А если есть хекс, который дает амплификацию от засветки фама, а не от наличия целевой молекулы - мне тоже его не включать? А может днк-технология поделится секретной информацией о том, как же я должен тогда на канале хекса отличать амплификацию от засветки?

Я бы на месте некоторых поменьше умничал здесь. Как на чужие наборы наезжать - так они первые. А тут тронули нормальный прибор, надо же. Кстати, чем-то мне все это напоминает общение с техподдержкой. Которые тоже убеждали в том, что все это нормально. Правда, догадаться о том, что у людей могут быть ДВА одинаковых прибора, один из которых работает нормально, а второй - нет, они не успели. И ответить на вопрос о такой странной загогулине не смогли. Просто растворились.
Нормальный прибор, да? Что еще рассказать, у меня много припасено?

Сообщение было отредактировано avial - 16.08.2016 01:08

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Ivalex
Участник оффлайн! Carbon Copy
Постоянный участник
So close no matter how far



 прочитанное сообщение 16.08.2016 23:04     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #47 множественное цитирование

(avial @ 14.08.2016 21:56)
Ссылка на исходное сообщение  Угу, расскажи про нормальную химию краевым эффектам того же биорада, когда крайние лунки без их костыля в виде бортика просто тупо выпариваются. Расскажи кросс-засветке ДТ-96, когда высокий сигнал по фаму дает кривую амплификации в хексе, хотя самого хекса в смеси нет вообще - вот тут особенно ценен совет про высокий сигнал/шум.
Именно поэтому серьезные фирмы валидируют тест-системы исключительно под свои приборы, а не пытаются "нормальной химией" исправить все косяки чужих.

Cross-talk между FAM и HEX каналами - болезнь многих qPCR инструментов. В частности такая же картина - со всеми Роторгенами, начиная с 400, когда их Corbett Research ещё клепал. Проблема - в кривых фильтрах, которые пропускают FAM сигнал в HEX канал. И калибровка никак это не лечит, так как этот эффект присутствовал на десятках машин, т.е. на лицо - конструкционные недостатки. У CFX Био-Рада вроде бы с этим всё в порядке было, а вот в QX200 ddPCR опять та же ерунда - "leaky" HEX канал. Но там можно от этого избавиться, поставив высокий "threshold". Да и FAM и HEX мултиплексы на ddPCR редко кто ставит.
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 16.08.2016 23:21     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #48 множественное цитирование

Еще сильнее можно заявить, что на самом деле кривые - FAM и HEX. Это ведь надо же было настолько поиздеваться, так близко спектры насинтезировать! Химикам следует внимательнее относиться к таким вещам!

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): NMR-guy
Участник оффлайн! avial
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 17.08.2016 01:07     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #49 множественное цитирование

Ага, помогут трешхолды, когда 10000 условных единиц фама дают 1000 условных единиц хекса. Не 10, не 100, а 1000!
И не какое-то небольшое поднятие хекса, как на других приборах, а вполне себе полноценная кривая, в точности копирующая по форме кривую фама, и вполне нормально определяющаяся софтом как положительная амплификация.
Про конструкционные недостатки можно было бы поверить, если бы не стояли два прибора одной и той же модели, в одном из которых все отлично, а другой - вот такой.

Сообщение было отредактировано avial - 17.08.2016 01:11

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): NMR-guy
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 17.08.2016 02:58     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #50 множественное цитирование

(avial @ 17.08.2016 02:07)
Ссылка на исходное сообщение  Ага, помогут трешхолды, когда 10000 условных единиц фама дают 1000 условных единиц хекса. Не 10, не 100, а 1000!
И не какое-то небольшое поднятие хекса, как на других приборах, а вполне себе полноценная кривая, в точности копирующая по форме кривую фама, и вполне нормально определяющаяся софтом как положительная амплификация.
Про конструкционные недостатки можно было бы поверить, если бы не стояли два прибора одной и той же модели, в одном из которых все отлично, а другой - вот такой.

[ррррррррр] гав гав гав гав... 1000... ууу... [гав-гав-гав-гав]... у-у-ууууу.... амплификация... у-у-у-

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): -Ъ-

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 19.03.24 08:48
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft