Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Angarad |
|
NMR-guy Постоянный участник временной жизни |
Гель есть на чем прогнать реакции? Если есть - грузите на гель и вешайте сюда картинку геля. |
Nett Постоянный участник |
Прогоните на приборе другой набор или свои праймеры, если есть, проблемы прибора тоже не исключены. Если ЕГ вам разработал уникальную систему - это вопрос к службе поддержки компании. 50 циклов - жесть какая-то. Сообщение было отредактировано Nett - 05.08.2016 14:20 |
kb1 Участник |
Мало информации. Где картинки? Что за набор? какие условия ПЦР? |
kblag Постоянный участник |
|
Angarad |
Протокол проведения пцр по Еврогену: 1. 95 градусов, 3 минуты(первый цикл) 2. 95 градусов, 10 секунд 3. 60 градусов, 30 секунд(здесь же замер флюоресценции) Пункты 2 и 3 повторяются 49 раз(по сути,1 цикл состоит из двух пунктов-пункта 2 и пункта 3).Рекомендации к проведению анализа от Евроген:установить циклы для анализа с 10 по 50(что меня в случае "ям" с 10 по 20 цикл,ясно дело,не устраивает). Добавлю: чаще всего "проваливается" FAM,HEX реже,но бывает.Также наблюдала и в образцах,и в контроле без матрицы(лунки разные) такую картину:с первого цикла один из красителей куда-то под потолок и далее на одном уровне до самого конца(не падает и не поднимается).Где-то тут на форуме уже был такой график(с красителем с первого цикла под потолок),почитала литературу-называют причину либо высокий изначальный уровень флюоресценции в образце,либо неправильную калибровку прибора.Здесь все,вообщем,более-менее ясно,а что за ерунда с "ямами",тоже калибровка,что ли?Жара тоже может быть,нет кондиционера и ледогенератора,только холодильники,а сейчас лето,сами понимаете(((Картинки постараюсь предоставить. |
NMR-guy Постоянный участник временной жизни |
Ваши чудеса могут объясняться мелкими капельками на крышках и стенках, которые теряют стабильность от конденсатата и бухаются в основной раствор, чем ОБРАТНО резко снижают концентрацию красителя. А так как в начале, первые 3 минуты при 95С вода испарялась БЕЗ КРАСИТЕЛЯ, дополняя конденсат на стенках, то кажущийся ноль красителя на первом цикле был искусственно завышен. Потому на фоне такого нуля после случайного обваливания капелек обратно в раствор. Хотя, такого рода процессы должны больше быть похожи не на "яму", а на обрыв и скачки, с плавным уползанием сигнала краски вверх и резким обрывом вниз. Яма то есть возникает резко вниз, потом плавно восстанавливается. 1. Откручивайте (сбрасывайте) закрытый планшет/стрипы перед установкой в термоблок в бакетном роторе. Переносите сброшенный планшет в термоблок медленно и аккуратно, без встряхиваний. 2. Проверьте, оптимально ли прижаты пробки пробирок в термоблоке в ходе реакции, при необходимости перекалибруйте высоту прижима. 3. Попробуйте после выполнения пп.1 и 2 изменить первый шаг (денатурацию при 95С) на 30с при 94С, остальные вторые периоды тоже снизьте температуру до 94С. Посмотрите, будет ли разница. |
Nett Постоянный участник |
Либо сразу топайте ногами на еврогеновцев, пусть предоставят какой-нибудь стрип с другой мишенью на проверку - в крайнем случае. |
Angarad |
Обещанные картинки.Первые две нормальный график до анализа(1 картинка) и после анализа с 10 по 50(2 картинка).Третья и четвертая-моя проблема до(3 картинка) и после анализа с 10 по 50(4 картинка).Пятая-рост HEX с первого цикла(не падает и не поднимается вплоть до самого конца),потом идет рост FAM.Если задать этому образцу анализ с 10 по 50-картинка будет как в норме.Ситуацию 5 часто вижу в пробирках без матрицы.Картинки 1,2,5-один и тот же пациент,только в дубле.Сами видите-один пациент,но две разные картины в графиках.Все приведенные графики получены в одной постановке. Картинки: ________1____50.gif — (385.95к) ________10____50.gif — (386.49к) ___________1____50.gif — (390.74к) ___________10____50.gif — (388.27к) ____________.gif — (389.6к) ____________.gif — (389.6к) |
kblag Постоянный участник |
Интереснее посмотреть на : Ужас в том,что такие "ямы" подчас возникают с 10 по 20 цикл,в некоторых случаях образуются две "ямы":одна с 1 по 10,другая- с 10 по 20.
|
NMR-guy Постоянный участник временной жизни |
Должен быть или уплотнительный винт или режим программы в котором прибор сам подбирает высоту зажатия пробирок. Так как у плашек и стрипов высота может быть разной - нужно обязательно разобраться в вопросе. Возможно Ваш прибор автоматически ее определяет и калибрует ее каждый новый раз как Вы туда что-то ставите и проблемы с этим нет. Если дело не в крышках - то какая-то таинственная хрень получается. Если бы дело было в испарении, то графики бы увеличивали бы ступенчато сигнал каждый цикл (из-за ступенчатого роста концентрации флуорофора). Тут же у Вас вообще два каких-то процесса конкурируют в пробирке. Ждем коммента главного еврогеновского Х-Перда по ихним китам, он тут всем и всегда предлагает что сделать и что у них купить, так что скоро вмешается комментами, думаю. |
kblag Постоянный участник |
|
ksm Постоянный участник |
Либо считывать лунки не с нуля начинайте, как на некоторых прогонах. Вообще странно - у вас очень низкий сигнал. Я с сайбром работаю - так он 4000-6000 ЦФУ дает разницу между базовой линией и плато у кривой (тот же прибор). Мне кажется, в вашем случае можно сказать, что ПЦР просто не идет... Сообщение было отредактировано ksm - 08.08.2016 11:12 |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Angarad @ 05.08.2016 23:00) Геля у нас нет,праймеров своих,к сожалению,тоже(((Наборы ГенЧек от Еврогена для детектирования SNP(генотипирование вообщем).Красители,используемые в данных наборах-FAM и HEX. Независимо от того какие мутации обнаруживаются, наследственные или соматические, использованный метод (зонды или аллельспецифические праймеры) "генотипирования вообщем" неудачный, плохо освоенный разработчиками (не умеют выбирать зонды ). Но , с другой стороны, этот рельеф (ямки, бугорочки) до 20-25 цикл. в пределах 100 rfu не страшно, если далее позитивный сигнал взлетает до 1000 и выше, а не еле-еле доползает до 200-300. На сайте Еврогена ни слова про этот набор, хорошо бы получить хоть какую-то минимальную инфу про метод - очень хочется помочь девушке. Остальные советы там про форез, высоту пробирок, крышку прибора и т. п. - ботва, дилетанские советы .
|
kblag Постоянный участник |
(ksm @ 08.08.2016 11:58) Вообще странно - у вас очень низкий сигнал. Я с сайбром работаю - так он 4000-6000 ЦФУ дает разницу между базовой линией и плато у кривой (тот же прибор). Мне кажется, в вашем случае можно сказать, что ПЦР просто не идет... Сайбр сигнал больше даёт. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(ksm @ 08.08.2016 11:58) Поиграйтесь с настройками базовой линии или порога, не помню - может помочь. Либо считывать лунки не с нуля начинайте, как на некоторых прогонах. Вообще странно - у вас очень низкий сигнал. Я с сайбром работаю - так он 4000-6000 ЦФУ дает разницу между базовой линией и плато у кривой (тот же прибор). Мне кажется, в вашем случае можно сказать, что ПЦР просто не идет... По сравнению с сайбром и значениями 6000, конечно, реакция не идет можно сказать. Но и такие высокие значения RFU тоже как говорят на востоке "очень хорошо тоже не хорошо" - потеряете чувствительность из-за частичного ингибирования реакции сайбром. Это небольшой офтоп, пардон.
|
Angarad |
|
Noom Постоянный участник |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Высокопрофильный пластик сейчас поискать надо, может его сейчас и не производят. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
|
kblag Постоянный участник |
Судите сами-на графике 3 явная гомозигота график 3 это последний? В нём после обрезки циклов канал HEX не выравнивается? Могли бы помочь кривые плавления,но не выдает их наш прибор почему-то((( в наборах ТакМаны без асимметрии - плавить нечего. |
kblag Постоянный участник |
В инструкции к набору есть алгоритм обработки и что там пишут про обрезку? |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
|
Nett Постоянный участник |
Из представленных графиков, где провал после 20 цикла - реакция не идёт. |
Angarad |
|
ksm Постоянный участник |
(-Ъ- @ 08.08.2016 12:47) По сравнению с сайбром и значениями 6000, конечно, реакция не идет можно сказать. Но и такие высокие значения RFU тоже как говорят на востоке "очень хорошо тоже не хорошо" - потеряете чувствительность из-за частичного ингибирования реакции сайбром. Это небольшой офтоп, пардон. Спасибо! Буду знать! В принципе, у меня обычно эффективность ПЦР близка к 100% по стандартным кривым, а там где нет - я поправку ввожу. Для относительной нормировки экспрессии это не играет роли, как я понял. А вообще Сайбр-мастер микс у меня от всеми так любимого Еврогена, но я в принципе им доволен - хорошо воспроизводится в разных экспериментах. Родной биорадовский несмотря на заверения о большом количестве циклов разморозки/заморозки, после каждого очередного оттаивания снижал эффективность на 20% примерно))) |
Guest IP-штамп: frOb1CBSDvrOc гость |
|
ship Постоянный участник Moscow |
(ksm @ 08.08.2016 21:38) Родной биорадовский несмотря на заверения о большом количестве циклов разморозки/заморозки, после каждого очередного оттаивания снижал эффективность на 20% примерно))) что значит снижал "эффективность" на 20%? вы же не проверяете эффективность пцр для каждой пары праймеров после каждой разморозки микса. или что вы опдразумеваете под эффективносстью? я работаю на биорадовских миксах, iTaq™ Universal SYBR® Green Supermix,нет никаких проблем. три дня, три разморозки, три повтора пцр для одних и тех же образцов- Ct варьирует в диапазоне меньше 1 цикл |
ksm Постоянный участник |
Т.е. раститровал ДНК, поставил ПЦР на миксе с 1-й разморозки, определил эффективность, скажем, 109%; заморозил мастер микс. Разморозил. Поставил с теми же ДНК-пробами и с размороженным мастер миксом новый ПЦР с теми же праймерами - получил 92%. Получается, что да, когда есть место в плашке - проверяю. Сообщение было отредактировано ksm - 09.08.2016 09:41 |
kblag Постоянный участник |
Вот если с 92% до 72% - то это интересней. |
ksm Постоянный участник |
Сообщение было отредактировано ksm - 09.08.2016 15:25 |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(-Ъ- @ 08.08.2016 15:24) Ну так что? |
kblag Постоянный участник |
(-Ъ- @ 09.08.2016 12:59) Выше писал - в наборах ТакМаны
|
ship Постоянный участник Moscow |
(ksm @ 09.08.2016 07:17) Ну, построил калибровочные кривые до и после разморозки. Т.е. раститровал ДНК, поставил ПЦР на миксе с 1-й разморозки, определил эффективность, скажем, 109%; заморозил мастер микс. Разморозил. Поставил с теми же ДНК-пробами и с размороженным мастер миксом новый ПЦР с теми же праймерами - получил 92%. Получается, что да, когда есть место в плашке - проверяю. а что за пробы? сколько там матрицы? вы не думаете, что пробы и праймеры тоже замораживаются-размораживаются и могут подваливаться? |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(kblag @ 09.08.2016 13:56) Простые ТакМаны так себя не ведут. Афтар не заморачивается что там за зонды, ему это как бы не надо знать. Но пользователю важно чтобы работая по Инструкции получались интерпретируемые результаты, без всяких творческих выкрутасов с "обрезанием начальных циклов" и т.д. Не могут нормальные ТакМаны, отличающиеся всего навсего одним нуклеотидом, выдавать такой рельеф с ямками. Высокий фон и низкое свечение - частое явление. Вы что-то там перемудрили, kblag. Это неудачная система для конкретного СНПа. Я бы переделал... Извините, забыл спрсить, а что есть Такманы без асимметрии? Неужели доморощенный термин? Или я сильно отстаю от новинок? Сообщение было отредактировано -Ъ- - 09.08.2016 13:45
|
kblag Постоянный участник |
(-Ъ- @ 09.08.2016 14:40) это я к вопросу о плавлении - имею ввиду, что ПЦР не асимметричная и плавить там зонды не получится |
ksm Постоянный участник |
(ship @ 09.08.2016 14:24) а что за пробы? сколько там матрицы? вы не думаете, что пробы и праймеры тоже замораживаются-размораживаются и могут подваливаться? ну, дцДНК раститровка для калибровки. Она и праймеры не размораживались/замораживались, а жили во льду все это время. кроме того, ДНК устойчивее к разморозке/заморозке в отличие от активности белков. в любом случае, спешу вас заверить, что виноват ТОЧНО не я! |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Angarad @ 08.08.2016 20:37) Ждем-с. Завершите достойно свою тему! Сообщение было отредактировано -Ъ- - 10.08.2016 14:42 |
Ivalex Участник |
Реактивы еврогеновские (qPCRmix HS), работаю не с SNP, а обычным RT-PCR Что мне удалось выяснить "опытным" путем: 1) "Провал" - хотя я бы скорее назвал это "наклоном", ведь если график визуально повернуть на n градусов, то он выглядеть будет нормально - напрямую связан с уровнем сигнала. Подобные явления встречались только на сильно разбавленном SYBR (или прошедшим много циклов заморозки-разморозки) и Taq-зондах. Это не связано с Еврогеном (по крайней мере напрямую) - зонды от Синтола также страдают от "упадочной болезни". Эту мысль подтверждает эксперимент с планшетами с пленками (Microseal B Bio-rad) и пробирками с "оптически чистыми" крышками (не Bio-rad). Через "оптически чистые" крышки сигнал идет чуть хуже и количество "наклонов" на эксперимент выше. 2) Обрезка циклов и выпрямление базовой линии своими руками (как тут советовали), конечно, решает проблему, но как уже сказал выше -Ъ- - хочется достоверных результатов без явно лишних маханий руками. 3) Проблема кстати не была видна на приборе Rotor-gene 3000, так что ИМХО - это проблема ПО. 4) Временное решение проблемы - это адекватное изменение количества зондов. Попробуйте двойные разведения. Можно еще попытаться поставить детекцию не с первого цикла, а с пятого-седьмого. Проблема может быть также связана с "глубоким нулем" на первых циклах Сообщение было отредактировано Ivalex - 11.08.2016 11:51 |
kblag Постоянный участник |
|
avial Постоянный участник |
У биорада вообще много проблем именно с математикой, к сожалению. Хотя околомедицинские лаборатории его очень любят за простоту. |
NMR-guy Постоянный участник временной жизни |
|
avial Постоянный участник |
Именно поэтому серьезные фирмы валидируют тест-системы исключительно под свои приборы, а не пытаются "нормальной химией" исправить все косяки чужих. |
NMR-guy Постоянный участник временной жизни |
Если хекса нет вообще - то зачем его включать? Чтобы написать очередную подстоенную гадость про нормальный прибор? Матрицу дискриминаций красителей при калибровке прибора никто не отменял. "Рассказать кроссзасветке" можно в любом криво откалиброванном амплификаторе, поскольку кроссзасветка - это свойство не прибора, а перекрывающихся спектров флуоресценции красителей... Первый-второй курс института. Дрейфуют спектры? - Перекалибровывать надо чаще, а не экономить на заварке. |
avial Постоянный участник |
А если есть хекс, который дает амплификацию от засветки фама, а не от наличия целевой молекулы - мне тоже его не включать? А может днк-технология поделится секретной информацией о том, как же я должен тогда на канале хекса отличать амплификацию от засветки? Я бы на месте некоторых поменьше умничал здесь. Как на чужие наборы наезжать - так они первые. А тут тронули нормальный прибор, надо же. Кстати, чем-то мне все это напоминает общение с техподдержкой. Которые тоже убеждали в том, что все это нормально. Правда, догадаться о том, что у людей могут быть ДВА одинаковых прибора, один из которых работает нормально, а второй - нет, они не успели. И ответить на вопрос о такой странной загогулине не смогли. Просто растворились. Нормальный прибор, да? Что еще рассказать, у меня много припасено? Сообщение было отредактировано avial - 16.08.2016 01:08
|
Carbon Copy Постоянный участник So close no matter how far |
(avial @ 14.08.2016 21:56) Угу, расскажи про нормальную химию краевым эффектам того же биорада, когда крайние лунки без их костыля в виде бортика просто тупо выпариваются. Расскажи кросс-засветке ДТ-96, когда высокий сигнал по фаму дает кривую амплификации в хексе, хотя самого хекса в смеси нет вообще - вот тут особенно ценен совет про высокий сигнал/шум. Именно поэтому серьезные фирмы валидируют тест-системы исключительно под свои приборы, а не пытаются "нормальной химией" исправить все косяки чужих. Cross-talk между FAM и HEX каналами - болезнь многих qPCR инструментов. В частности такая же картина - со всеми Роторгенами, начиная с 400, когда их Corbett Research ещё клепал. Проблема - в кривых фильтрах, которые пропускают FAM сигнал в HEX канал. И калибровка никак это не лечит, так как этот эффект присутствовал на десятках машин, т.е. на лицо - конструкционные недостатки. У CFX Био-Рада вроде бы с этим всё в порядке было, а вот в QX200 ddPCR опять та же ерунда - "leaky" HEX канал. Но там можно от этого избавиться, поставив высокий "threshold". Да и FAM и HEX мултиплексы на ddPCR редко кто ставит. |
ksm Постоянный участник |
|
avial Постоянный участник |
И не какое-то небольшое поднятие хекса, как на других приборах, а вполне себе полноценная кривая, в точности копирующая по форме кривую фама, и вполне нормально определяющаяся софтом как положительная амплификация. Про конструкционные недостатки можно было бы поверить, если бы не стояли два прибора одной и той же модели, в одном из которых все отлично, а другой - вот такой. Сообщение было отредактировано avial - 17.08.2016 01:11
|
ksm Постоянный участник |
(avial @ 17.08.2016 02:07) Ага, помогут трешхолды, когда 10000 условных единиц фама дают 1000 условных единиц хекса. Не 10, не 100, а 1000! И не какое-то небольшое поднятие хекса, как на других приборах, а вполне себе полноценная кривая, в точности копирующая по форме кривую фама, и вполне нормально определяющаяся софтом как положительная амплификация. Про конструкционные недостатки можно было бы поверить, если бы не стояли два прибора одной и той же модели, в одном из которых все отлично, а другой - вот такой. [ррррррррр] гав гав гав гав... 1000... ууу... [гав-гав-гав-гав]... у-у-ууууу.... амплификация... у-у-у-
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |