Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
kblag Постоянный участник |
софт уже давно считает первую производную, вторую, Cy0 - что угодно, только не Ct? справедливости ради, Рош считает именно Ct, но только по намертво зашитым порог (что тоже, конечно, вариант для сходимости результатов и у разных лабораторий, правда спорный). При этом вычитает фон по своим космическим формулам и строит модель кривой по разработкам некоего Нобель со странными взглядами на ПЦР. Сообщение было отредактировано kblag - 09.11.2017 22:42 |
Carbon Copy Постоянный участник So close no matter how far |
(avial @ 09.11.2017 20:03) ...Для тех, кто в танке - пробы с парами Cp 24.8/25.0 и 24.0/24.4 имеют РАЗНЫЕ генотипы. Успехов тебе по циклам генотипировать. Мне кажется я понял, в чём проблема. Похоже на чрезвычайно запущеный случай отвратительной специфичности ТакМан проб. У вас что ТакМаны на противоположный аллель поднимаются? Это гдеж такое видано. Что за мутации? СНИПы? Eсли единичные замены, я ещё пойму, там да, трудно добиться нормальной специфичности. У молеkулярных биконов, кстати избирательность гораздо выше. MGB-пробы тоже помогают. |
avial Постоянный участник |
Да, если ты измеряешь Ct по пороговой линии - ты сможешь добиться разделения аллелей, просто задрав ее на середину экспоненты, но это будет просто инвертированием измерения той же флуоресценции. Пример тебе специально был приведен с низкой специфичностью на низких температурах отжига (надеюсь, для тебя не будет сюрпризом то, что при изменении температуры специфичность тоже меняется?), но он очень ярко иллюстрирует само обсуждаемое явление - нельзя на такманах при генотипировании пользоваться циклами, это неправильно с точки зрения самого механизма аллельной дискриминации по зондам, только конечная точка и никак иначе. Ты же, не разобравшись, сходу начал с оскорблений. Причем претензии даже к этим зондам неясны - что, какие-то проблемы разобраться в генотипах? Может просто потому что разбираться надо правильно - именно по конечной точке, а не выдумывать новые методы? А если у тебя специфичность высокая и кривая от чужого аллеля просто лежит - то никакими циклами ты тем более воспользоваться не сможешь, потому что их просто не будет для этих лежащих кривых. |
avial Постоянный участник |
(kblag @ 09.11.2017 20:42) справедливости ради, Рош считает именно Ct, но только по намертво зашитым порог (что тоже, конечно, вариант для сходимости результатов и у разных лабораторий, правда спорный). При этом вычитает фон по своим космическим формулам и строит модель кривой по разработкам некоего Нобель со странными взглядами на ПЦР. Был лучшего мнения о роше) Но справедливости ради, их подход действительно дает более-менее равные результаты между приборами без учета человеческого фактора. |
kblag Постоянный участник |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(kblag @ 10.11.2017 10:58) Пусть расцветают сто цветов: по Ct хорошо отсекать недогруз и перегруз по входному количеству ДНК, по конечной точке определять генотипы. Ставьте контроли, и да пребудет с вами Сила. Да Вы художник! Запишу себе в цитатник пока не забыл.
|
Carbon Copy Постоянный участник So close no matter how far |
(avial @ 10.11.2017 07:06) Нет, проблему ты не понял. Проблема в том, что концентрация такман-зонда практически не влияет на положение точки перегиба кривой - только на высоту этой кривой. Причем независимо от специфичности зондов - изменяется не Cp кривых у разных аллелей, изменяется их подъем, что ты ошибочно принимаешь за сдвиг циклов. А если у тебя специфичность высокая и кривая от чужого аллеля просто лежит - то никакими циклами ты тем более воспользоваться не сможешь, потому что их просто не будет для этих лежащих кривых. avial, всеё понятно с тобой. Выбрось свои ТакМаны в педальное ведро. Сам небось дизайнил? Если у тебя "кривая чужого аллеля не лежит", то не о чем и разговаривать. Низкая специфичность ТакМанов - единственная причина измерения аллельной дискриминации по конечной флуоресценции. Хотя проблема в целом решаемая - MGB работает очень хорошо, можно и единичные замены нуклеотидов детектировать. Молекулярные биконы намного личше линейных проб, правда с ними нужно потанцевать немножко, чтобы найти "окно дискриминации". Когда специфичность проб высокая и кривая противоположного аллеля вовсе не кривая, а прямая - в этой ситуации аллель ную дискриминацию можно считать по Ct и это будет самый правильный метод. И всё работает прекрасно, никакие "облака" генотипов нафиг не нужны. Но, уж если так хочется мерять конечную флуоресценцию - её соотношение у гомо- гетеро- и гомозигот будет идеально: 1, 1/2, и 0. Вобщем, сначала нужно научиться реал-тайм пробы нормальные делать, а потом уж пенять на БиоРад. Плохому молбиолуху всегда Биорад мешает. |
kblag Постоянный участник |
Нужно определиться: можно вообще работать с кривыми зондами или нет. Я бы выкинул ВСЕ! Да, и чтобы не стоять в стороне, зонды, с которых началась эта тема год назад - мои желающие могут тоже проголосовать за их уничтожение |
avial Постоянный участник |
Ты вот эти зонды назвал тухлыми? Серьезно? Тогда пример нетухлых в студию! Ответь на один простой вопрос - какую проблему в генотипировании решает твой анализ по циклам? Сколько он приносит проблем - тебе уже тут объяснили, в чем преимущества его использования? Сможешь назвать? А самое смешное, что мои зонды, как и зонды kblag в этой теме есть, а великому эксперту по такманам почему-то пришлось картинку в интернете искать. Это уже говорит абсолютно все о твоих реальных знаниях и умениях, теоретик. Сообщение было отредактировано avial - 11.11.2017 11:13 |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |