Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Вопрос о пцр real-time
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! kblag
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 09.11.2017 22:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

софт уже давно считает первую производную, вторую, Cy0 - что угодно, только не Ct?

справедливости ради, Рош считает именно Ct, но только по намертво зашитым порог (что тоже, конечно, вариант для сходимости результатов и у разных лабораторий, правда спорный). При этом вычитает фон по своим космическим формулам и строит модель кривой по разработкам некоего Нобель со странными взглядами на ПЦР.

Сообщение было отредактировано kblag - 09.11.2017 22:42
Участник оффлайн! Carbon Copy
Постоянный участник
So close no matter how far



 прочитанное сообщение 09.11.2017 23:22     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

(avial @ 09.11.2017 20:03)
Ссылка на исходное сообщение...Для тех, кто в танке - пробы с парами Cp 24.8/25.0 и 24.0/24.4 имеют РАЗНЫЕ генотипы. Успехов тебе по циклам генотипировать.

Мне кажется я понял, в чём проблема. Похоже на чрезвычайно запущеный случай отвратительной специфичности ТакМан проб. У вас что ТакМаны на противоположный аллель поднимаются? Это гдеж такое видано. Что за мутации? СНИПы? Eсли единичные замены, я ещё пойму, там да, трудно добиться нормальной специфичности. У молеkулярных биконов, кстати избирательность гораздо выше. MGB-пробы тоже помогают.
Участник оффлайн! avial
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.11.2017 09:06     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Нет, проблему ты не понял. Проблема в том, что концентрация такман-зонда практически не влияет на положение точки перегиба кривой - только на высоту этой кривой. Причем независимо от специфичности зондов - изменяется не Cp кривых у разных аллелей, изменяется их подъем, что ты ошибочно принимаешь за сдвиг циклов.
Да, если ты измеряешь Ct по пороговой линии - ты сможешь добиться разделения аллелей, просто задрав ее на середину экспоненты, но это будет просто инвертированием измерения той же флуоресценции.
Пример тебе специально был приведен с низкой специфичностью на низких температурах отжига (надеюсь, для тебя не будет сюрпризом то, что при изменении температуры специфичность тоже меняется?), но он очень ярко иллюстрирует само обсуждаемое явление - нельзя на такманах при генотипировании пользоваться циклами, это неправильно с точки зрения самого механизма аллельной дискриминации по зондам, только конечная точка и никак иначе. Ты же, не разобравшись, сходу начал с оскорблений.

Причем претензии даже к этим зондам неясны - что, какие-то проблемы разобраться в генотипах? Может просто потому что разбираться надо правильно - именно по конечной точке, а не выдумывать новые методы?
А если у тебя специфичность высокая и кривая от чужого аллеля просто лежит - то никакими циклами ты тем более воспользоваться не сможешь, потому что их просто не будет для этих лежащих кривых.
Участник оффлайн! avial
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.11.2017 09:07     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

(kblag @ 09.11.2017 20:42)
Ссылка на исходное сообщение  справедливости ради, Рош считает именно Ct, но только по намертво зашитым порог (что тоже, конечно, вариант для сходимости результатов и у разных лабораторий, правда спорный). При этом вычитает фон по своим космическим формулам и строит модель кривой по разработкам некоего Нобель со странными взглядами на ПЦР.

Был лучшего мнения о роше)
Но справедливости ради, их подход действительно дает более-менее равные результаты между приборами без учета человеческого фактора.
Участник оффлайн! kblag
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.11.2017 09:58     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Пусть расцветают сто цветов: по Ct хорошо отсекать недогруз и перегруз по входному количеству ДНК, по конечной точке определять генотипы. Ставьте контроли, и да пребудет с вами Сила.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 10.11.2017 14:37     Сообщение для модератора         Личное письмо

(kblag @ 10.11.2017 10:58)
Ссылка на исходное сообщение  Пусть расцветают сто цветов: по Ct хорошо отсекать недогруз и перегруз по входному количеству ДНК, по конечной точке определять генотипы. Ставьте контроли, и да пребудет с вами Сила.

Да Вы художник! Запишу себе в цитатник пока не забыл. shuffle.gif

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): kblag
Участник оффлайн! Carbon Copy
Постоянный участник
So close no matter how far



 прочитанное сообщение 10.11.2017 17:39     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

(avial @ 10.11.2017 07:06)
  Нет, проблему ты не понял. Проблема в том, что концентрация такман-зонда практически не влияет на положение точки перегиба кривой - только на высоту этой кривой. Причем независимо от специфичности зондов - изменяется не Cp кривых у разных аллелей, изменяется их подъем, что ты ошибочно принимаешь за сдвиг циклов.
А если у тебя специфичность высокая и кривая от чужого аллеля просто лежит - то никакими циклами ты тем более воспользоваться не сможешь, потому что их просто не будет для этих лежащих кривых.

avial, всеё понятно с тобой. Выбрось свои ТакМаны в педальное ведро. Сам небось дизайнил? Если у тебя "кривая чужого аллеля не лежит", то не о чем и разговаривать. Низкая специфичность ТакМанов - единственная причина измерения аллельной дискриминации по конечной флуоресценции. Хотя проблема в целом решаемая - MGB работает очень хорошо, можно и единичные замены нуклеотидов детектировать. Молекулярные биконы намного личше линейных проб, правда с ними нужно потанцевать немножко, чтобы найти "окно дискриминации". Когда специфичность проб высокая и кривая противоположного аллеля вовсе не кривая, а прямая - в этой ситуации аллель ную дискриминацию можно считать по Ct и это будет самый правильный метод. И всё работает прекрасно, никакие "облака" генотипов нафиг не нужны. Но, уж если так хочется мерять конечную флуоресценцию - её соотношение у гомо- гетеро- и гомозигот будет идеально: 1, 1/2, и 0. Вобщем, сначала нужно научиться реал-тайм пробы нормальные делать, а потом уж пенять на БиоРад. Плохому молбиолуху всегда Биорад мешает.
Участник оффлайн! kblag
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.11.2017 22:17     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Кстати Carbon Copy выше приводил рисунок, в котором разница сигнала у зондов отличается в 10 раз, но выкинуть их в педальное ведро готов не был - предлагался анализ по циклам, а вот зонды avialа, так сразу и в ведро...
Нужно определиться: можно вообще работать с кривыми зондами или нет.

Я бы выкинул ВСЕ! smile.gif

Да, и чтобы не стоять в стороне, зонды, с которых началась эта тема год назад - мои smile.gif желающие могут тоже проголосовать за их уничтожение rolleyes.gif
Участник оффлайн! avial
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.11.2017 23:05     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Тебе был показан пример работы зондов в неоптимальных условиях сниженной температуры отжига. Для демонстрации того, что Cp не зависит от генотипа для аллельной дискриминации на такманах. Надеюсь, ты понимаешь, что даже самые идеальные зонды работают только в определенном диапазоне температур и всегда есть температура, ниже которой начинает появляться непецифика? Или не понимаешь? А на последней картинке тех же самых зондов что тебе не нравится - давай, попробуй выкрутиться?
картинка: EPX_709_64GC.jpg
Ты вот эти зонды назвал тухлыми? Серьезно? Тогда пример нетухлых в студию!

Ответь на один простой вопрос - какую проблему в генотипировании решает твой анализ по циклам? Сколько он приносит проблем - тебе уже тут объяснили, в чем преимущества его использования? Сможешь назвать?

А самое смешное, что мои зонды, как и зонды kblag в этой теме есть, а великому эксперту по такманам почему-то пришлось картинку в интернете искать. Это уже говорит абсолютно все о твоих реальных знаниях и умениях, теоретик.

Сообщение было отредактировано avial - 11.11.2017 11:13
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  20.11.2021 18:25     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

https://wanelo.co/replicarolexwatches
https://musescore.com/fakerolexwatches
https://www.racked.com/users/Replicarolexwatches
https://sketchfab.com/Rolexrelicawatches
http://www.video-bookmark.com/bookmark/433...eplica-watches/
https://www.slideserve.com/ReplicawatchesUK...pt-presentation
https://www.theverge.com/users/Replicarolexwatches
https://www.yumpu.com/en/document/read/6532...lica-watches-uk
https://online.flippingbook.com/view/152275247/
https://www.instapaper.com/p/8767342
https://www.bigblueview.com/users/Replicarolexwatches
https://weheartit.com/watcheshutuk
https://sites.google.com/view/replicarolexwatches24/home
https://www.indiehackers.com/post/hints-on-...atch-113aef73a9
http://replicawatchesuk.esportsify.com/for...ica-rolex-watch

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 19.03.24 14:07
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft