Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Вопрос о пцр real-time
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! NMR-guy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 17.08.2016 17:55     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #51 множественное цитирование

(avial @ 17.08.2016 01:07)
Ссылка на исходное сообщение  Ага, помогут трешхолды, когда 10000 условных единиц фама дают 1000 условных единиц хекса. Не 10, не 100, а 1000!
И не какое-то небольшое поднятие хекса, как на других приборах, а вполне себе полноценная кривая, в точности копирующая по форме кривую фама, и вполне нормально определяющаяся софтом как положительная амплификация.
Про конструкционные недостатки можно было бы поверить, если бы не стояли два прибора одной и той же модели, в одном из которых все отлично, а другой - вот такой.

Все же предлагаю чаще калиброваться. Если в софте нет возможности настройки режекции всего того, что лезет из соседних спектральных окон (то есть невозможна калибровка на произвольные спектры красителей и любые их перекрывающиеся сочетания) - фтопку эти приборы. Со всеми фильтрами. Сейчас уже 2016 год на дворе, а не 1816, когда отсекать свет можно было только по аналоговому принципу, то есть - светофильтрами.
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 18.08.2016 02:27     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #52 множественное цитирование

(NMR-guy @ 17.08.2016 18:55)
Ссылка на исходное сообщение  Все же предлагаю чаще калиброваться. Если в софте нет возможности настройки режекции всего того, что лезет из соседних спектральных окон (то есть невозможна калибровка на произвольные спектры красителей и любые их перекрывающиеся сочетания) - фтопку эти приборы. Со всеми фильтрами. Сейчас уже 2016 год на дворе, а не 1816, когда отсекать свет можно было только по аналоговому принципу, то есть - светофильтрами.

Вы серьезно считаете что в наш век свет можно отсечь как-то иначе?!
Участник оффлайн! NMR-guy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 18.08.2016 03:57     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #53 множественное цитирование

Я не считаю. Цифровой фильтрации сигнала уже лет 50. Равно как и нормировке сигнала в реальном времени на сигнал того или иного химического эталона в растворе. Запись ЯМР-сигнала белков без этого была бы принципиально невозможна.

Не вижу проблем это "прикрутить" и к детекторам флуоресценции. Уверен, что к большинству всё это уже "прикручено".
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 18.08.2016 12:57     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #54 множественное цитирование

Кстати, кто-нибудь калибровал CFX? какова цена вопроса?
Участник оффлайн! Ivalex
Участник



 прочитанное сообщение 18.08.2016 13:47     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #55 множественное цитирование

(ksm @ 18.08.2016 13:57)
Ссылка на исходное сообщение  Кстати, кто-нибудь калибровал CFX? какова цена вопроса?



Я попросил их (Bio-rad) прокалибровать мне новый краситель, мне ответили "Купите краситель и прокалибруйте согласно мануалу"

Так что цена вопроса, вероятно, равна цене красителя и нескольких пробирок

Сообщение было отредактировано Ivalex - 18.08.2016 13:48
Участник оффлайн! NMR-guy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 18.08.2016 13:56     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #56 множественное цитирование

Вообще калиброваться свежими стандартами положено самим. Калибровать нужно всю матрицу, что есть. Если это 96 лунок - то все 96 лунок.

Кстати, проблема с ДТ-96 может быть вызвана тем, что они используют для калибровки твердотельные эталоны, спектр которых не на 100% соответствует жидким лункам, в особенности со всеми краевыми эффектами и дрейфе максимумов флуоресценции при нагревании растворов.
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 18.08.2016 14:05     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #57 множественное цитирование

А, т.е. они просто плашку с краской продадут. Ясно.
Участник оффлайн! NMR-guy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 18.08.2016 14:22     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #58 множественное цитирование

Да нет. Вы краску не экономьте и не разбавляйте, калибруйте строго по протоколу. Разлить смеси можно и самому. Краски от этого не изменятся. Проблема вся в том, что это дорого, поэтому многие этим не занимаются.

Хотя, я понятия не имею что в конкретном протоколе биорада для этой калибровки нужно делать. В идеале, это должна быть плашка не с одной краской а со всеми, на детекцию которых создан прибор. В калибровке есть смысл как раз в основном для создания матрицы коэффициентов режекции соседей на максимумах поглощения СМЕСИ красителей.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): ksm
Участник оффлайн! Ivalex
Участник



 прочитанное сообщение 18.08.2016 14:36     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #59 множественное цитирование

(NMR-guy @ 18.08.2016 15:22)
Ссылка на исходное сообщение  
Хотя, я понятия не имею что в конкретном протоколе биорада для этой калибровки нужно делать. В идеале, это должна быть плашка не с одной краской а со всеми, на детекцию которых создан прибор. В калибровке есть смысл как раз в основном для создания матрицы коэффициентов режекции соседей на максимумах поглощения СМЕСИ красителей.


"Для каждого флуорофора заполните четыре лунки по 50 мкл (96-луночный планшет) или по 30 мкл (384-луночный планшет) раствором красителя объемом 300 нм. Помните, что, по крайней мере, половина планшета содержит пустые лунки" - цитата из мануала CFX96. Судя по всему, калибровка каждого красителя (как предустановленного, так и нового) идет отдельно, но на один 96 планшет можно впихнуть до 12 красителей.

Вот только меня смущает формулировка "заполните ... по 50 мкл раствором красителя объемом 300 нм". Что в данном случае обозначате "нм"?
Участник оффлайн! NMR-guy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 18.08.2016 15:01     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #60 множественное цитирование

это опечатка, скорее всего.

4 лунки? ювгадабикиддинми! mad.gif даже если тупить и хатурить, но нужно 4 угловых + центральную калибровать отдельно. Итого = 5.
Участник оффлайн! Ivalex
Участник



 прочитанное сообщение 18.08.2016 15:27     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #61 множественное цитирование

(NMR-guy @ 18.08.2016 16:01)
Ссылка на исходное сообщение  это опечатка, скорее всего.

4 лунки? ювгадабикиддинми!  mad.gif даже если тупить и хатурить, но нужно 4 угловых + центральную калибровать отдельно. Итого = 5.



Но в планшете четное число рядов и колонок. Получается, что калибровать надо 4 угловых и 4 центральных, так как точный центр не имеет лунки? Если нет, то по какому признаку выбираем "центр"?
Guest
IP-штамп: frxNT2eRFXwrw
гость



 прочитанное сообщение 18.08.2016 15:51     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #62 множественное цитирование

ребят, ведь у ЦеэФИкса "бегает" считывалка. какая вообще разница, в какой позиции стоят пробирки с краской?!
Участник оффлайн! Ivalex
Участник



 прочитанное сообщение 18.08.2016 16:11     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #63 множественное цитирование

(Guest @ 18.08.2016 16:51)
Ссылка на исходное сообщение  ребят, ведь у ЦеэФИкса "бегает" считывалка. какая вообще разница, в какой позиции стоят пробирки с краской?!


Пожалуй, вы правы. Я припомнил этот факт, но уверенность NMR меня смутила
Участник оффлайн! NMR-guy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 18.08.2016 23:41     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #64 множественное цитирование

А пельтье у него тоже бегает? smile.gif

Вообще, я тут почитал про ваш CFX96 - беру всё сказанное назад. В нём нет никакой цифровой режекции спектров. Похоже, всем вообще наплевать на кросс-засветки. Туда влепили дешевые аналоговые стекляшки светофильтров и некие вялые поправки на всё, что они недодавливают.

Если химия сделана плохо и красители зондов не разведены по окну по краям (FAM-Cy5), то калибровка особо ничего и не даст. Соболезнования в общем. И пожелание - не снижать никогда порог положительной детекции ниже 20% максимума от положительного контроля реакции по каждому каналу. Если канал дает S-образную кривую менее 20% от максимума положительного контроля - считать это отсутствием амплификации. Если же химия плохо отработана или шаблон ДНК плохой - то понятно что с таким прибором такие киты работать просто не будут.
Участник оффлайн! Carbon Copy
Постоянный участник
So close no matter how far



 прочитанное сообщение 19.08.2016 02:45     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #65 множественное цитирование

(NMR-guy @ 18.08.2016 21:41)
Ссылка на исходное сообщение  А пельтье у него тоже бегает? smile.gif

Вообще, я тут почитал про ваш CFX96 - беру всё сказанное назад. В нём нет никакой цифровой режекции спектров. Похоже, всем вообще наплевать на кросс-засветки. Туда влепили дешевые аналоговые стекляшки светофильтров и некие вялые поправки на всё, что они недодавливают.

Если химия сделана плохо и красители зондов не разведены по окну по краям (FAM-Cy5), то калибровка особо ничего и не даст. Соболезнования в общем. И пожелание - не снижать никогда порог положительной детекции ниже 20% максимума от положительного контроля реакции по каждому каналу. Если канал дает S-образную кривую менее 20% от максимума положительного контроля - считать это отсутствием амплификации. Если же химия плохо отработана или шаблон ДНК плохой - то понятно что с таким прибором такие киты работать просто не будут.

NMR-guy, чё ты гонишь тут вообще?! Какие 20%? Ты qPCR хоть раз ставил на любом циклере? Такое впечатление что ты тут народ пытаешься усиленно сбить с толку своими нелепицами. Порог детекии или limit of detection меряется по Ct, а не дельте конечной флуоресценции, которая может быть любая, в том числе и намного меньше 20% при поздних Ct-s. Какой положительный контроль? По всем канонам реал-тайма должны быть множественные контроли с известными концентрациями, а не один положительный контроль. Какая разница - по краям реакции или в центре, когда оптическая система CFX - челночная, как тебе уже тут написали. И даже и если и есть минимальная разница в температурах в силу теплопроводимости термоблока, и она может чуть-чуть влиять на эффективность PCR - на флюоресценцию то это какое действие оказывает? Светофильтры ему не нравятся, а CFX в этом отношении - отличная машина, нет кросс-тока никакого в отличие от многих других циклеров, потому как это - MJ Research а не Bio-Rad. Интересно, какие ещё фантазии ты в этот топик накидаешь? Давай, не стесняйся, интернет-сообщество реал-тайм экспердов в нетерпеливом ожидании. Или ты мне опять ответишь объявлением фола?

Всего благодарностей: 6Поблагодарили (6): -Ъ-, Ivalex, bee3, Bern5, Inkerin Liitto, макрофаг
Участник оффлайн! NMR-guy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 19.08.2016 10:52     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #66 множественное цитирование

Вы у меня в игноре, поскольку не умеете общаться с людьми на профессиональные темы. Я вижу, что Вы меня цитируете, посему предполагаю, что обращаетесь ко мне. Повесьте еще одну идиотскую оскорбительную картинку или повеселите людей своим сверхценным мнением еще как нибудь. wink.gif

Хорошая химия в китах - это постоянный высокий подъём S-кривой при амплификации. Начинающийся на разных циклах, но не заканчивающийся на 20% уровня положительного контроля. А поднимающийся хотя бы до его половины. Или больше. Если это условие не выполняется - у вас нет ни кита, ни метода для измерения чего-то.
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 19.08.2016 14:16     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #67 множественное цитирование

(NMR-guy @ 19.08.2016 00:41)
Ссылка на исходное сообщение  А пельтье у него тоже бегает? smile.gif

Вообще, я тут почитал про ваш CFX96 - беру всё сказанное назад. В нём нет никакой цифровой режекции спектров. Похоже, всем вообще наплевать на кросс-засветки. Туда влепили дешевые аналоговые стекляшки светофильтров и некие вялые поправки на всё, что они недодавливают.

Если химия сделана плохо и красители зондов не разведены по окну по краям (FAM-Cy5), то калибровка особо ничего и не даст. Соболезнования в общем. И пожелание - не снижать никогда порог положительной детекции ниже 20% максимума от положительного контроля реакции по каждому каналу. Если канал дает S-образную кривую менее 20% от максимума положительного контроля - считать это отсутствием амплификации. Если же химия плохо отработана или шаблон ДНК плохой - то понятно что с таким прибором такие киты работать просто не будут.

зато бегающий детектор позволяет одинаково считывать всю плашку, что особенно важно, когда ведут количественное исследование с САЙБРом и когда заполнены все 96 лунок

Сообщение было отредактировано ksm - 19.08.2016 15:01
guest: NMR-guest
IP-штамп: frld8daoi1xbI
гость



 прочитанное сообщение 19.08.2016 14:53     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #68 множественное цитирование

Слово "анализ" неприменимо, если не выполняются критерии его воспроизводимости и НЕ УСТАНОВЛЕНА стандатная ошибка измерения. А ее величина обязательно будет зависеть от разницы эффективности размножения ампликонов разных позициях планшета. Ложноположительные амплификации, стоны по поводу кросс-засветок - это флаг кривых и недоделанных протоколов измерений, часто инвалидных уже со стадии своего проектирования. Погуглите QbD и уясните уже наконец, что нормальные киты для работы можно сделать только когда химия делается с учетом особенностей железа и софта, софт - с учетом ограничений железа и предельного качества имеющейся химии, а железо - в расчете на минимальную цену максимальной воспроизводимости ТОЛЬКО СВОЕЙ ХИМИИ.

Хотя, если вам уже все равно - то конечно диалог теряет смысл.
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 19.08.2016 15:00     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #69 множественное цитирование

Хорошо. Специально для вас изменяю слово "анализ" на слово "исследование"
Участник оффлайн! Ivalex
Участник



 прочитанное сообщение 01.09.2016 12:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #70 множественное цитирование

Пара вопросов ТС:

1) Как ваше общение с Еврогеном?

2) Как долго у вас хранились зонды (и в каких условиях) прежде чем графики начали кланяться?
Участник оффлайн! Angarad




 прочитанное сообщение 08.09.2016 16:56     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #71 множественное цитирование

Евроген посоветовал резать первые 10 циклов(что я и так знаю). Особенности биорадовского прибора говорят(какие именно,не уточнили). Зонды по-разному,но по срокам годности на упаковке рабочие. На -20 градусов.
Биорад(писала и им) подло молчит пока. Вообще склоняюсь к мысли,что это прибор. С каждым разом все больше таких графиков странных,на слетающую калибровку очень похоже(по поведению).И по-мойму, у прибора что-то с коэффициентом.Получила недавно два графика в одной постановке(один и тот же пациент).Невооруженным глазом видно, что они идентичны и совпадают.Но один от другого отстоит как бы чуть в стороне.Вырезала 10 циклов-полностью совпали,тютелька в тютельку.Но это так,мои теории,может я за недостатком опыта и неправа.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Ivalex
Guest
IP-штамп: fr53a1NDCUyvE
гость



 прочитанное сообщение 08.09.2016 19:22     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #72 множественное цитирование

(Angarad @ 08.09.2016 16:56)
Ссылка на исходное сообщениеНевооруженным глазом видно, что они идентичны и совпадают.Но один от другого отстоит как бы чуть в стороне.Вырезала 10 циклов-полностью совпали,тютелька в тютельку.Но это так,мои теории,может я за недостатком опыта и неправа.

из-за начального загиба, даже если графики очень похожи, прибор может выбрать очень разную область фона (он считает загиб за начало роста кривой) - получаются очень разные результаты вычитания фона.
Участник оффлайн! kblag
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.09.2016 19:23     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #73 множественное цитирование

(Guest @ 08.09.2016 20:22)
Ссылка на исходное сообщение  из-за начального загиба, даже если графики очень похожи, прибор может выбрать очень разную область фона (он считает загиб за начало роста кривой) - получаются очень разные результаты вычитания фона.


забыл залогиниться...
Участник оффлайн! Angarad




 прочитанное сообщение 01.11.2017 18:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #74 множественное цитирование

И снова здравствуйте!С момента создания темы прошел год,набралась опыта,переговорила с Еврогеном,источник проблемы(см.предыдущие мои сообщения) найден.Решила опубликовать свой опыт на форуме и тем самым закрыть эту тему,ну и мало ли кому-то пригодится)))
Итак,на данную ситуацию повлиял комплекс проблем:
1.)Нестабильность Taq-man зондов.Дело в том,что стабилизация уровня флуоресценции в разных наборах Еврогена,протекает по-разному:где-то уровень выравнивается раньше,где-то-позже.Я об этом не знала и исходя из того,что на все наборы-одна программа амплификации,ставила в одну постановку разные наборы.Прибору же все равно какие наборы,он по умолчанию считает,что все они стабилизируется одинаково.Как итог-в одних пробах уровень уже стабилизировался,в других-еще нет,прибор все гонит под одну гребенку и в итоговом анализе-куча артефактов.
2.)Проблема с родным софтом Биорада.Точнее,с аналитической программой CFX Menedger для постобработки данных.Недавно мы ее обновили-стала гораздо лучше распознавать графики и если теперь возникает какой-то артефакт(редко,но бывает.См. пункт 1) в 95% случаев читает аллельную дискриминацию правильно.Также гораздо лучше стала распознавать данные,прошедшие ручную корректировку(см.ниже)-раньше с этим были серьезные проблемы.
Выводы:
1.)По возможности не ставить разные наборы Еврогена в одну постановку.В случае постановки разных наборов одновременно,полученные данные нуждаются в ручной корректировке(см. ниже);
2.)Необходимо проводить ручную корректировку данных после анализа.Здесь два способа:
а.)Пользуясь инструкцией к набору от Еврогена,скорректировать пороговый уровень базовой линии в образцах-для каждого набора это индивидуально.К сожалению,на нашем приборе это решает только 90% проблем,в остальных 10%-появляются новые артефакты(((
б.)Исключить из анализа первые 10 циклов.Имхо,лучший способ.Универсален для всех наборов,решает 95% проблем(оставшиеся 5%-изначально плохо поставленные образцы:малое количество днк в пробе и тд.),часто решает данную проблему полностью;
3.)Обновить софт Биорада. Константация факта-после обновления намного лучше стало.
Вот как-то так.Надеюсь,кому-нибудь это поможет)))
П.С.:в данной теме также обсуждался вопрос о регулировке уровня крышки,как возможного источника моей проблемы.Так вот, хотя CFX96 подбирает высоту крышки автоматически,при постановке стрипов с пробами в амплификатор,необходимо их уравнивать с обеих сторон плашки(это если ставится меньше 12 стрипов,т.е. меньше 96 образцов).Т.е. если ставить в данный амплификатор 8 стрипов,то 4 стрипа ставите с левого края и 4-с правого.Это необходимо,что давление крышки на пробирки распределялось равномерно.Данная рекомендация прописана в инструкции к прибору.

Всего благодарностей: 2Поблагодарили (2): kblag, ksm
Участник оффлайн! avial
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 02.11.2017 12:18     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #75 множественное цитирование

Хм, я что-то раньше не подумал об аллельной дискриминации - а разве биорад ее рисует по обработанным кривым, а не по уровню флуоресценции в интересующем цикле?
Вот чего-чего, а на АБИ при генотипировании никогда не было проблем с неправильной обработкой кривых, более того - этот шаг вообще пропускать можно.
Участник оффлайн! kblag
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 02.11.2017 12:51     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #76 множественное цитирование

разве биорад ее рисует по обработанным кривым, а не по уровню флуоресценции в интересующем цикле?

биорад сейчас рисует по уровню флуоресценции, но если кривые обработались "криво", то и уровень флуоресценции будет неправильный.
Для примера:
вот нормальная кривая
картинка: good.png
и вот после неправильной обработки
картинка: bad.png

в этом случае сигнал будет ниже и генотип неправильно определится.


АБИ для алельной дискриминации, насколько я помню, измеряет флуоресценцию до ПЦР и после ПЦР (сама кривая ПЦР не учитывается). В этом случае обработка не влияет на результат.
Участник оффлайн! lmb

Минск



 прочитанное сообщение 02.11.2017 22:28     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #77 множественное цитирование

А, если не секрет, каким пластиком пользуетесь? каталожник можно?
Участник оффлайн! lmb

Минск



 прочитанное сообщение 02.11.2017 22:30     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #78 множественное цитирование

Также для анализа пробовали такое:
В верхнем меню зайти в раздел «Settings/Baseline Setting» уставновить галочки напротив пунктов «Apply Fluorescence Drift Correction» и «Baseline Subtracted Curve fit»?

У нас софт на английском, извиняюсь.
Участник оффлайн! avial
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 05.11.2017 22:52     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #79 множественное цитирование

Биорад как всегда гениален - что мешало сделать анализ просто по уровню флуоресценции?
Участник оффлайн! Carbon Copy
Постоянный участник
So close no matter how far



 прочитанное сообщение 07.11.2017 01:05     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #80 множественное цитирование

(avial @ 05.11.2017 20:52)
  Биорад как всегда гениален - что мешало сделать анализ просто по уровню флуоресценции?

А что мешало avial выучить азы реал-тайм ПЦР? И таки да, по сравнению с дремучей безграмотностью avial Био-Рад наверное действительно гениален.
Участник оффлайн! avial
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.11.2017 10:07     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #81 множественное цитирование

А можно поинтересоваться - в анализе по конечной точке нахрена вообще реал-тайм ПЦР? Или некоторые не в курсе, что менее гениальные приборы не требуют гонять плашку обязательно в режиме реал-тайм, чтобы просто нарисовать облака генотипов?
Дремучие и безграмотные вообще гоняли плашки на верити параллельно несколько штук, а потом засовывали в один StepOne, в то время как гении покупали для этого десяток биорадов. Каждому свое.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): kblag
Участник оффлайн! kblag
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.11.2017 10:36     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #82 множественное цитирование

avial, мне ряд пользователей так и не удалось переубедить, что для анализа генотипов смотреть на кривые им не нужно smile.gif

Всего благодарностей: 2Поблагодарили (2): dk, avial
Участник оффлайн! avial
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.11.2017 14:05     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #83 множественное цитирование

Тут, видимо, что-то личное у человека с биорадом, поэтому в копилку биорадовской гениальности - это еще и идиотская система выделения этих облаков, которая позволяет только разделять поле анализа на прямоугольные зоны. Очень удобно, когда расхождение облаков неполное.
А самое кретинское - это пароль на файле с прибора, который является на самом деле зип-архивом. То есть, эта скотина на мной же полученные данные ставит пароль. Конечно, закрытый формат, все такое, но это как минимум неуважение к пользователю.
Биорад также одна из очень немногих контор, которые не давали скачать управляющий софт бесплатно (сейчас-то хоть можно - сто лет его уже не видел?) - то есть, не имея прибора, посмотреть содержимое его файлов было крайне проблематично.
Участник оффлайн! kblag
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.11.2017 14:56     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #84 множественное цитирование

кстати, интересно, что в версии 3 убрали возможность выставить пороги для разделения.

А пароль вскрывается wink.gif Но смотреть там особо нечего, так как формат кривой и, видимо, от стыда за такой индусский код поставили пароль. Проще с RDML работать.

скачать управляющий софт бесплатно

при регистрации на сайте скачать можно бесплатно, денег просят за русификацию smile.gif
Участник оффлайн! avial
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.11.2017 15:12     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #85 множественное цитирование

Поняли наконец-то, что за деньги он нафиг никому не нужен.
Участник оффлайн! Carbon Copy
Постоянный участник
So close no matter how far



 прочитанное сообщение 08.11.2017 17:50     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #86 множественное цитирование

(avial @ 08.11.2017 08:07)
Ссылка на исходное сообщение  А можно поинтересоваться - в анализе по конечной точке нахрена вообще реал-тайм ПЦР? Или некоторые не в курсе, что менее гениальные приборы не требуют гонять плашку обязательно в режиме реал-тайм, чтобы просто нарисовать облака генотипов?
Дремучие и безграмотные вообще гоняли плашки на верити параллельно несколько штук, а потом засовывали в один StepOne, в то время как гении покупали для этого десяток биорадов. Каждому свое.

Поинтересоваться конечно можно. И я Вам отвечу. Вы по всей видимости из клиники и гоняете свои ПЦР на коммерческих наборах. Т.е. Ваши условия близки к идеальным - постоянное и достаточное количество ДНК матрицы и известные флюоресцентные уровни ТакМан проб, которые очевидно обладают хорошей специфичностью и избирательностью. Поэтому, идентификация аллелей для Вас не представляет особого труда, так как соотношение сигнала к шуму очень велико. Однако в реальности реал-тайм ПЦР использыется для очень широкого спектра задач от детекции патогенов до экспрессии генов. И там, я Вам скажу не всё так однозначно. К Био-Раду я кстати дышу достаточно ровно, не беспокойтесь. Их iCycler был вообще откровенное дерьмо.
Участник оффлайн! kblag
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.11.2017 18:01     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #87 множественное цитирование

Carbon Copy, Вы про avial совсем не угадали smile.gif

Однако в реальности реал-тайм ПЦР использыется для очень широкого спектра задач от детекции патогенов до экспрессии генов.

мы тут аллельную дискриминацию разбираем
Участник оффлайн! avial
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.11.2017 18:47     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #88 множественное цитирование

Ага, а космические корабли бороздят просторы большого театра.
Речь о такманах и именно аллельной дискриминации, по-моему, в моем комменте это было написано достаточно ясно и недвусмысленно? И речь именно о том, что в данном конкретном примении биорад делает избыточный шаг по анализу кривых, так как от этого только лишние проблемы возникают. Конечно, экспрессия генов в этом контексте очень к месту.
Участник оффлайн! Carbon Copy
Постоянный участник
So close no matter how far



 прочитанное сообщение 08.11.2017 19:20     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #89 множественное цитирование

Ну вот вам пример - стырил из Интернета и не могу точно утверждать, что за эксперимент ставился и что это была аллельная дискриминация. Как видно уровни флуоресценции ТакМанов различаются кардинально, в то время как Ct-s более-менее близки. При хорошей ПЦР химии и конечная флуоресценция разных аллелей и Ct-s должны быть идентичными. Но, в реальности в зависимости от кривизны проб и оптической системы циклера это не всегда так. Поэтому и приходится извращаться с "облаками", как вы их назвали. Всё становится гораздо хуже, когда цонцентрация ДНК падает (поздние Ct-s).

user posted image
Участник оффлайн! kblag
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.11.2017 20:06     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #90 множественное цитирование

И что тут по Вашему: гетерозиготы? Если да, то это и по конечной точке определить можно. Только вот тырить нужно картинки в которых есть все аллели, тогда и разговор будет. Пока есть впечатление, что Вы слабо себе представляете аллельную дискриминацию.
Участник оффлайн! Carbon Copy
Постоянный участник
So close no matter how far



 прочитанное сообщение 08.11.2017 21:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #91 множественное цитирование

А у меня пока есть впечатление, что с тобой вообще никакого разговора не будет. Свои дешёвые понты и впечатления о моих представлениях можешь оставить при себе, дурилка картонная.
Участник оффлайн! kblag
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.11.2017 22:03     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #92 множественное цитирование

Это называется весь молбиол в одном посте smile.gif Написать ерунду, а дураками считать окружающих.

Сообщение было отредактировано kblag - 08.11.2017 22:08
Участник оффлайн! Carbon Copy
Постоянный участник
So close no matter how far



 прочитанное сообщение 08.11.2017 22:56     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #93 множественное цитирование

Самокритика всегда приветствуется, в том числе и на Молбиоле.
Участник оффлайн! avial
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 09.11.2017 08:36     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #94 множественное цитирование

И к чему эта картинка?
Не думал, что на молбиоле придется ликбез проводить, но, видимо, таков сейчас уровень.
Обсуждаемая аллельная дискриминация основана на конкуренции двух зондов за место на ампликоне, в зависимости от степени комплементарности и свойств самих зондов получается различная эффективность разрушения каждого из двух зондов полимеразой и разное разгорание (повышение флуоресценции) для разных красок/аллелей. В идеальном случае при гомозиготах поднимается только одна кривая соответствующего зонда, при гетерозиготе - обе. В реальности, конечно, есть всегда разная степень неспецифики.
Поэтому кривые для анализа аллельной дискриминации на такманах для групп образцов не нужны вообще, они не дают никакой полезной информации и их даже анализировать не нужно, об этом тебе и писали. Никакие пороговые циклы к этому анализу вообще отношения не имеют. Достаточно измерить фоновую флуоресценцию в начале ПЦР и итоговую в конце ПЦР - расхождение облаков красителей даст полную информацию о генотипах.

Ну и кто тут азов ПЦР не знает, а?

Сообщение было отредактировано avial - 09.11.2017 08:39
Участник оффлайн! TMV




 прочитанное сообщение 09.11.2017 11:51     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #95 множественное цитирование

Уважаемый Коллега!

Приглашаю Вас на вебинар/ лекцию: "ПЦР реального времени и MIQE – стандарт и методические рекомендации международных экспертов для работы c технологией qPCR".

Автор и лектор – эксперт AWTech Телков М.В., к.б.н., молекулярный биолог и генный инженер с большим стажем практической работы и преподавания.

Вебинар состоится 23 ноября с.г. с 10.00 до 12.00 по Московскому времени.

Участи платное – 500 руб. Для участия надо предварительно пройти по ссылке: https://events.webinar.ru/2963331/697653

Описание вебинара есть на сайте компании: http://www.awtec.ru/courses/799/

"ПЦР реального времени и MIQE – стандарт и методические рекомендации международных экспертов для работы c технологией qPCR".

Содержание : В ответ на вал (многие тысячи) публикаций, содержащих малообоснованные и часто неверные выводы из экспериментов с применением технологии ПЦР реального времени (qPCR), известные международные эксперты и основатели технологии qPCR в 2009 году опубликовали набор методических рекомендаций MIQE, в которых описали КАК НАДЛЕЖИТ применять технологию qPCR, чтобы получать достоверные данные и как нужно описывать эксперименты qPCR в своих публикациях.

Однако, плохо продуманные и неряшливо выполненные работы, содержащие необоснованные выводы из экспериментов ПЦР реального времени, продолжают выходить в свет, что вызывает тревогу у экспертов (S.Bustin and J.Hugget. Reproducibility of Biomedical Reserch – the importance of editorial vigilance. Biomedical Detection and Quantification. 11 (2017) 1-3; S.Bustin and C.Wittwer. MIQE: A Step Toward More Robust and Reproducible Quantitative PCR. (2017) Clinical Chemistry, 63:9).

На вебинаре к.б.н. Телкова М.В. будут рассмотрены причины появления стандарта MIQE, его требования, а также даны методические рекомендации по надлежащей оптимизации этапов qPCR.

Лекция адресована исследователям из академической и прикладной науки, преподавателям, аспирантам и студентам биологических, медицинских, ветеринарных и сельскохозяйственных ВУЗов, а также специалистам КДЛ, использующим ПЦР реального времени в своей работе.
Лекция заинтересует и тех, кто применяет в работе методы гибридизации (микрочипы), микрофлуидные технологии или NGS, поскольку детектируемые этими методами изменения экспрессии генов или хромосомные аномалии, согласно принятому в настоящее время порядку, должны быть подтверждены qPCR.

План вебинара:

1. ПЦР реального времени (qPCR): история, принципы технологии и основные приложения.
2. Стандарт MIQE: причины появления и его рекомендации (The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments).
3. Практическая оптимизация и валидация экспериментов qPCR.
4. Выводы.
Участник оффлайн! Carbon Copy
Постоянный участник
So close no matter how far



 прочитанное сообщение 09.11.2017 17:21     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #96 множественное цитирование

Картинка демонстрирует, что соотношение signal to noise может быть очень разным для двух аллельспецифичных TaqMan проб. "Разгорание", как его тут обозвали, зелёной пробы в 10 раз больше красной, т.е. соотношение красного сигнала к шуму будет гораздо меньше зелёного. "Облако" позитивных гетерозиготных ответов красной пробы будет висеть очень низко и в некоторых случаях, например при низкой концентрации ДНК и поздних CT-s, программа ошибочно интерпретирует их как негативные, т.е. гетерозигота превратится в зелёную гомозиготу. Зависит, конечно от fluorescence threshold и от избирательности проб. В идеале "разгорание" проб должно быть сопоставимым, но, как я уже отметил, это не всегда так, и картинка - тому подтверждение. К сожалению я должен согласиться, что software практически всех реал-тайм циклеров считает аллельную дискриминацию по дельте конечной флюоресценции. Хотя на мой взгляд гораздо правильнее было бы делать вычисления на основе CT-s, которые должны быть независимы от корявости TaqMan проб и равны для обоих аллелей. По крайней мере в сомнительных случаях всегда можно вручную покрутить кривульки и отличить гомо- от гетерозигот.
Участник оффлайн! kblag
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 09.11.2017 18:52     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #97 множественное цитирование

Carbon Copy, я ведь не зря спросил гетерозиготы у Вас на картинке или нет. И про то, что нет других генотипов. Раз уж Вы рассматриваете реальные ситуации, то без этой информации нельзя анализировать и с циклами и без них.

Если рассматривать только анализ по циклам, то он может дать здесь ложную гетерозиготу, как минимум, по двум причинам: неспецифический отжиг одного из зондов или кривая калибровка (слишком большой сигнал от одного из зондов). Кстати, в этом случае анализ по конечной точке будет достоверней - сигнал от неспицифического отжига сместит "облака" гетерозиготы и гомозиготы, но на их расхождение не повлияет. Хорошо это можно наблюдать в старых версиях софта от Биорада, там можно анализировать двумя способами.
Низкий сигнал от одного из зондов не критичен для дискриминации по конечной точке если он стабилен и есть возможность изменять пороги отсечения (как было у Биорада или в лучшей реализации у Роша) или применяя метод k-средних (как АБИ).

Но в целом, ещё раз повторю, данная картинка ни о чём не говорит без всех возможных генотипов.

Вообще разговор был про то, зачем биорад "портит" нормальные кривые. Если Вы посмотрите на мой рисунок, то метод Ct тут не применим (как и по конечной точке).
Участник оффлайн! avial
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 09.11.2017 22:03     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #98 множественное цитирование

Запомни раз и навсегда - в такманах интенсивность флуоресценции НЕ ВЛИЯЕТ на вероятность перепутывания генотипов по одной простой причине - кластерный анализ при недостаточном расхождении облаков просто не выдаст ответ вообще. Все, на что влияет твое "соотношение сигнал/шум" - это то, насколько далеко разойдутся облака. При совсем хреновом соотношении они смешаются и ничего ты не сможешь прогенотипировать вообще даже с Ct.
И когда при генотипировании возникает ситуация с "поздними Ct", надо не вручную результаты разбирать (все равно ошибешься), а праймеры нормальные подбирать и зонды.

Как же задолбали теоретики, генотипирующие по Ct, порог ты как будешь выставлять, на глаз? Может поэтому в роше ты даже настройки такой не найдешь, потому что нормальный софт уже давно считает первую производную, вторую, Cy0 - что угодно, только не Ct?
Вот тебе результат не из гугла - практически одинаковые Cp видишь?
картинка: 2017_11_09_21_46_20.png

Думаешь, одинаковый генотип?
Хрен там:
картинка: 2017_11_09_21_43_54.png
Совершенно четкое разделение облаков там, где казалось бы примерно одинаковые Cp. Сможешь ответить, почему так? Может это тебе надо вспомнить азы ПЦР, прочитать, что такое пороговый цикл, от чего он зависит? Может хоть тогда дойдет, какой бред ты тут понаписал?
Для тех, кто в танке - пробы с парами Cp 24.8/25.0 и 24.0/24.4 имеют РАЗНЫЕ генотипы. Успехов тебе по циклам генотипировать.

Сообщение было отредактировано avial - 09.11.2017 22:13
Участник оффлайн! Carbon Copy
Постоянный участник
So close no matter how far



 прочитанное сообщение 09.11.2017 22:06     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #99 множественное цитирование

Картинка не моя, я только разместил обьяву ©. Её происхождение мне неведомо, и если рассуждать о возможных причинах, таки да тут может быть всё что угодно - от низкой неспецифичности проб (зондов в российской терминологии), до дефективной оптики, согласен. Однако, если всё так плохо, нужно выкидывать либо тухлые ТакМаны, либо циклер с корявыми протекающими фильтрами, и надолго забыть о генотипировании. Ручная настройка fluorescence threshold была всегда во всех машинах и я очень удивлюсь , если Био-Рад лишил юзеров такой возможности вдруг.
Участник оффлайн! kblag
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 09.11.2017 22:35     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Ручная настройка fluorescence threshold была всегда во всех машинах и я очень удивлюсь , если Био-Рад лишил юзеров такой возможности вдруг.

лишили возможности выставить порог для аллельной дискриминации, для Ct порог пока оставили. Хотя может в новом CFX Maestro всё вернули назад. Никто не пользовался этой программой?
И да, неуёмный биорад продаёт её за 1000$ smile.gif При этом русская версия стоит 3145$, китайская 2925$, а версия для мака 150$ confused.gif

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 19.03.24 14:32
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft