Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Малый выход РНК -- Мало РНК из культуры инфицированных кл --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Tatsiana




 прочитанное сообщение 16.05.2018 18:34     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Здравствуйте, уважаемые участники форума! Подскажите, пожалуйста, в чем может быть проблема низкой концентрации РНК. Клетки в планшете инфицировали микоплазмой, через 24-72 часа собирали супернатант, каждый раз добавляли после этого в планшет RLT буфер из Quagen набора на пару минут, собирали лизаты и выделяли РНК по протоколу. При анализе на Nanodrop концентрация от 2.7 до 20 нг на мкл. Очень мало. В чем может быть причина? Заранее благодарна
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 16.05.2018 19:55     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

добрый день, дорогая Татьсияна.
я не специалист по инфецированию, но полагаю что проблемы следующие:
1. "рукожопие"
а) кривые руки при постановке эксперимента;
б) низкорасположенные руки при фиксации материала;
в) неспособность пользоваться протоколом;
г) неверная интерпретация результатов пользования нанодропом, т.к. РНК по сути не выделилась.
2. если я не прав в п.1, то проблемы в чем-то ином
а) мало материала
б) испорченный кит
в) плохой нанодроп
Участник оффлайн! ASDF
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 16.05.2018 21:41     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Какие лунки? Т.е. сколько вы ожидали получить? 20 нг на мкл это 1 мкг в 50 мкл, а это много, а не мало.
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 16.05.2018 21:51     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Объем лунки, количество клеток? Может у вас там клеток хрен да маленько?
ну и присоединяюсь к предыдущему оратору 1 ЕСЛИ речь о 96луночном планшете, то это нормальное такое количество.
Участник оффлайн! Tatsiana




 прочитанное сообщение 17.05.2018 07:01     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Спасибо за ответы! Уточню. Планшет 24-луночный, клетки BEAS-2B, концентрация клеток 10(6) в лунке. В итоге в 6 лунках от 2 до 5 нг, в 7 лунках от 5 до 10, в 5 лунках от 10 до 15 нг и в 6 лунках от 15 до 20 нг.
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 17.05.2018 12:28     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Объем элюции то какой? то есть какой выход РНК с одной лунки?
примерный выход РНК из миллиона клеток от 10 до 30 мкг в зависимости от типа клеток.
ну и если даже выход низкий - то этого все равно хватит например для обратной транскрипции.
если у вас конечно более-менее нормальная ревертаза и вы умеете делать RT.
Участник оффлайн! Tatsiana




 прочитанное сообщение 17.05.2018 13:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

(ship @ 17.05.2018 13:28)
Ссылка на исходное сообщение  Объем элюции то какой?  то есть какой выход РНК с одной лунки?
примерный выход РНК из миллиона клеток от 10 до 30 мкг в зависимости от типа клеток.
ну и если даже выход низкий - то этого все равно хватит например для обратной транскрипции.
если у вас конечно более-менее нормальная ревертаза и вы умеете делать RT.


РНК из одной лунки экстрагировалась в объем 30 мкл (остальные лунки аналогично), концентрации РНК после измерения на Nanodrop составили от порядка 2 до 20 нг на мкл объема экстракции (30 мкл), таким образом, выход РНК в лунках варьировал от 60 до 600 нг в 30 мкл?
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 17.05.2018 13:57     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

клетки BEAS-2B это что за клетки? я очень сильно сомневаюсь что в лунке 24 луночного планшета вы сможете комфортно разместить такое количество клеток. вы уверены что не ошиблись на порядок с количеством клеток?
потому что если так - то выход 600 нг вполне адекватен.
Участник оффлайн! Tatsiana




 прочитанное сообщение 17.05.2018 14:16     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

(ship @ 17.05.2018 14:57)
Ссылка на исходное сообщение  клетки BEAS-2B это что за клетки? я очень сильно сомневаюсь что в лунке 24 луночного планшета вы сможете комфортно разместить такое количество клеток. вы уверены что не ошиблись на порядок с количеством клеток?
потому что если так - то выход 600 нг вполне адекватен.


BEAS-2B - клетки бронхиального эпителия человека. Извините за несильную грамотность в этом вопросе ( у меня только 1,5 месяца опыта работы с культивированием клеток). Вы подразумеваете, что в данном случае мы добавили больше клеток, чем может вместить планшет, в итоге неприкрепленные клетки не вносят вклад в суммарную РНК, и выход соответствует гораздо меньшему количеству клеток, которые прикрепились к планшету? Грубо говоря, мы внесли 10(6), прикрепились 10(5), последние обеспечили выход РНК?
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 17.05.2018 14:46     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

(Tatsiana @ 17.05.2018 12:16)
Ссылка на исходное сообщение  BEAS-2B - клетки бронхиального эпителия человека. Извините за несильную грамотность в этом вопросе ( у меня только 1,5 месяца опыта работы с культивированием клеток). Вы подразумеваете, что в данном случае мы добавили больше клеток, чем может вместить планшет, в итоге неприкрепленные клетки не вносят вклад в суммарную РНК, и выход соответствует гораздо меньшему количеству клеток, которые прикрепились к планшету? Грубо говоря, мы внесли 10(6), прикрепились 10(5), последние обеспечили выход РНК?

Все может быть. Они могут как не прикрепиться и сдохнуть, так и размножиться. Поэтому считать на внесенное количество клеток несколько некорректно. Обычно с контрольной лунки собирают интактные клетки и их считают, если уж клетки в лунках доя выделения рнк недоступны доя подсчета. Или снимают клетки, считают, а потом выделяют. Это если аналит (в вашем случае рнк) нужно нормировать по количеству клеток.
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 17.05.2018 15:52     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

(Tatsiana @ 17.05.2018 12:16)
Ссылка на исходное сообщение  BEAS-2B - клетки бронхиального эпителия человека. Извините за несильную грамотность в этом вопросе ( у меня только 1,5 месяца опыта работы с культивированием клеток). Вы подразумеваете, что в данном случае мы добавили больше клеток, чем может вместить планшет, в итоге неприкрепленные клетки не вносят вклад в суммарную РНК, и выход соответствует гораздо меньшему количеству клеток, которые прикрепились к планшету? Грубо говоря, мы внесли 10(6), прикрепились 10(5), последние обеспечили выход РНК?

Ну вы на лунки то смотрели хотя бы после рассева клеток? если вы по миллиону бухнули в лунку это видно будет, что там не просто монослой, а огромная куча клеток. может они не прикрепились и вы их, или сдохли от такой высокой плотности и открепились, или мало ли что еще вы не так сделали.

Научитесь считать и культивировать клетки, посейте их в разной плотности, определите какая оптимальная и тп. потом уже за выделение РНК беритесь.

Мы со сходными линиями работаем, обычно по 80 000 клеток в 24 луночный сеется.
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 17.05.2018 15:55     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

(vb @ 17.05.2018 12:46)
Ссылка на исходное сообщение   Или снимают клетки, считают, а потом выделяют.

вот это точно не нужно делать ни при каких обстоятельствах!
и вообще, концентрация РНК определяется и далее исходя из нее все нормируется.
а количество клеток - ого все равно ни при рассеве и потом реально точно определить невозможно, если только не гонять суспензию через ФАКС, и концентрация РНК это более точный параметр.
Участник оффлайн! Tatsiana




 прочитанное сообщение 17.05.2018 16:04     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

(ship @ 17.05.2018 16:52)
Ссылка на исходное сообщение  Ну вы на лунки то смотрели хотя бы после рассева клеток? если вы по миллиону бухнули в лунку это видно будет, что там не просто монослой, а огромная куча клеток. может они не прикрепились и вы их, или сдохли от такой высокой плотности и открепились, или мало ли что еще вы не так сделали.

Научитесь считать и культивировать клетки, посейте их в разной плотности, определите какая оптимальная и тп.  потом уже за выделение РНК беритесь.

Мы со сходными линиями работаем, обычно по 80 000 клеток в 24 луночный сеется.


Спасибо большое!
Участник оффлайн! Horse-radish
Участник



 прочитанное сообщение 17.05.2018 16:30     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

Культура капризная вроде. Вы их на коллаген сеете?
Участник оффлайн! Tatsiana




 прочитанное сообщение 18.05.2018 00:03     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

(Horse-radish @ 17.05.2018 17:30)
Ссылка на исходное сообщение  Культура капризная вроде. Вы их на коллаген сеете?

Нет, коллаген не используем
Участник оффлайн! Tatsiana




 прочитанное сообщение 18.05.2018 00:06     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

(ship @ 17.05.2018 16:52)
Ссылка на исходное сообщение  Ну вы на лунки то смотрели хотя бы после рассева клеток? если вы по миллиону бухнули в лунку это видно будет, что там не просто монослой, а огромная куча клеток. может они не прикрепились и вы их, или сдохли от такой высокой плотности и открепились, или мало ли что еще вы не так сделали.

Научитесь считать и культивировать клетки, посейте их в разной плотности, определите какая оптимальная и тп.  потом уже за выделение РНК беритесь.

Мы со сходными линиями работаем, обычно по 80 000 клеток в 24 луночный сеется.


Подскажите, пожалуйста, а размер Ваших клеток сопоставим с BEAS-2B, BEAS-2B сравнительно маленькие клетки.
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 18.05.2018 12:36     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

сравнительно с чем маленькие? у нас тоже клетки бронхиального эпителия.
размер у них достаточно большой, например по сравнению с HEK293.
на важна еще скорость пролиферации.

ни одни клетки нельзя посеять в 24луночный в плотности 10(6)
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 18.05.2018 13:00     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

(ship @ 17.05.2018 13:55)
Ссылка на исходное сообщение  вот это точно не нужно делать ни при каких обстоятельствах! 
и вообще, концентрация РНК определяется и далее исходя из нее все нормируется.
а количество клеток - ого все равно ни при рассеве и потом реально точно определить невозможно, если только не гонять суспензию через ФАКС, и концентрация РНК это более точный параметр.

Чейта? Всяко делают.
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 18.05.2018 16:47     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

(vb @ 18.05.2018 11:00)
Ссылка на исходное сообщение  Чейта? Всяко делают.

трипсинизация, в отличие от промывки ПБС, это уж точно сильный стресс для клеток, что может повлиять на профиль экспресии генов.
При трипсинизации или снятии версеном разрушаются адгезионные контакты, происходит сильное изменение формы клетки, плюс механический стресс при пипетировании и тп и тд.
Участник оффлайн! Tom1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 20.05.2018 19:36     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

"Клетки в планшете инфицировали микоплазмой,"
==================================
Почему-то никто не обатил внимания....

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 25.05.18 10:26
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft