molbiol.ru -> gel shiftы

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* gel shiftы

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

yack
moderator
Москва, Россия

05.06.2003 18:59

URL #1

Народ, подскажите какой-нибудь ресурс по subj или кто своими протоколами поделится?
В принципе задача такая - SRF и его сайт связывания. Я трансфецирую свой белок в клетку и похоже при этом SRF с ДНКи сваливается. А может и не сваливается

Masha1
Постоянный участник

05.06.2003 19:05

URL #2

кинула промеговский протокольчик на мыло...

[Текст переведён с транслита]

yack
moderator
Москва, Россия

05.06.2003 20:44

URL #3

Спасибо большое, у меня вообще ситуация дурная несколько, смотреть надо не связывание, а диссоциацию, или вернее уменьшение связывания.
А Вы не в курсе насчет нерадиоактивных шифтов? Если заказать DIG-oligo или там с биотином? Тут проблема дурацко-организационная, я только что переехал, работать с радиоактивностью мне просто негде, если только ночью под подушкой

Ну а сколько занимают инструктажи и оборудование места, соответствующего правилам работы, я даж представить себе боюсь.

guest123
Участник

05.06.2003 20:50

URL #4

Почему-би не попробовать тогда так:

Биотинилируете олиг, цепляте ны стрептавидин, инкубируете со своим белком, все что не связалось отмиваете, все что связалось смотрите на вестерне.

[Текст переведён с транслита]

guest123
Участник

05.06.2003 20:50

URL #5

Почему-би не попробовать тогда так:

Биотинилируете олиг, цепляте на стрептавидин, инкубируете со своим белком, все что не связалось отмиваете, все что связалось смотрите на вестерне.

[Текст переведён с транслита]

[Текст переведён с транслита]

Masha1
Постоянный участник

05.06.2003 20:58

URL #6

Ну, пометить можно как угодно, в принципе - лишь бы это с сайтом связывания не интерферировало...
А вот про то, что Вы делать собственно хотите, я как-то не догнала...
"Я трансфецирую свой белок в клетку и похоже при этом СРФ с ДНКи сваливается" - имеется в виду, что Вы трансфецируете каким-то другим белком, который конкурирует с SRF за сайт связывания? Если это так, то гель-шифтом это решается легко (конкуренцией)

[Текст переведён с транслита]

[Текст переведён с транслита]

yack
moderator
Москва, Россия

05.06.2003 21:14

URL #7

Если бы так просто, да нет, это типичный черный ящик. Я не знаю сколько ступенек от моего белка до SRFа (есть подозрения, масса косвенных данных и полная уверенность, что напрямую они не конкурируют)

guest123
О! наверно так и попробую сделать. Другой вопрос хватит ли чуствительности

guest123
Участник

05.06.2003 21:28

URL #8

Masha1
Постоянный участник

05.06.2003 21:29

URL #9

Ясненько...А Ваш белок, который не СРФ, про него чего-нибудь известно? Функция, хотя бы предполагаемая...
Насчет очистки на стрептавидине - идея хорошая, мы сами так белки чистим (РНК-связывающие). Правда, в последний раз начистили какую-то хрень полную, а мой белок (который при кросс-линке и при гель-шифте великолепно с РНК связывается) с такой колонкой не связался вообще

А гел-ьшифтом Вы что хотели конкретно посмотреть - разницу между контрольным экстрактом и экстрактом из трансфецированных клеток?
[Текст переведён с транслита]

guest123
Участник

05.06.2003 21:29

URL #10

sorry, glyuk

yack
moderator
Москва, Россия

05.06.2003 21:45

URL #11

разницу между контрольным экстрактом и экстрактом из трансфецированных клеток?

Угу, именно, тут много НО, естественно, но это надо пробовать.

Midgardsormen
Постоянный участник

05.06.2003 22:15

URL #12

Masha1 - от koff зависит будет ли твой белок сидеть на колонке и как долго (X-linking koff убивает

)
yack - если тебя in vivo ситуация интересует, то причем тут шифты? Сделай ChIP.

Masha1
Постоянный участник

05.06.2003 22:22

URL #13

"от кофф зависит будет ли твой белок сидеть на колонке и как долго"
ето я понимаю...но на band-shift я же его вижу!!! То есть не так-то он плохо на моей РНКе висит...

yack
moderator
Москва, Россия

06.06.2003 19:34

URL #14

Про ChIP поподробнее можно?

Midgardsormen
Постоянный участник

07.06.2003 05:50

URL #15

ChIP - берешь клетки, кросслинк там все нафиг глутаральдегидом, лизируешь, соникируешь - экспериментально определяешь чтобы ДНК повалилась на куски 0.5-2 kb, сажаешь на колонку с антителами против твово белка чего сядет, элюируешь комплекс, реверс кросслинк, далее определяешь где на ДНК твой белок сидел. Если знаешь секвенс того, где ты его ищещь, то можно просто PCRом. Если есть геномный чип, то метишь ДНКу и делаешь microarray, so called ChIP-chip assay. Если нисиво не знаешь и чипа нету, тогда просто клонируешь всю ДНК, что с кросслинка снял и секвенируешь - это пожалуй дороже и дольше всего.
Masha - я ж не знаю как ты EMSA ставишь, часто связывание определяют по исчезновению свободной пробы, а не появлению классического шифта. В этом случае комплекс может быть нестабильным настолько, что на колонку толком не сядет.

yack
moderator
Москва, Россия

07.06.2003 19:44

URL #16

Да нет, задачи определить сайт связывания у меня собственно не стоит. Вернее стоит, но выбор в данном промоторе вполне минимальный - либо SRF либо NF-kappaB. По косвенным литературным данным получается, что должен быть SRF. Я уже заказал биотинилированный олиг по статье 1991 года, где они SRF биохимически начистили, посмотрим что получится. Правда я тут понял, что придется стабильную трансфекцию сделать на случай, если эффект будет не по принципу 'все или ничего'. Просто в шифте на одном геле я вижу и свободный и связанный, что позволяет оценить соотношение между ними, здесь же буду видеть только связанный.
О, да, кстати, ни у кого под рукой нету ссылки на работы, где NLS вводили в белок.

07.06.2003 20:12

URL #17

Привет, ученые! Скажите ка, а сколько разных промоторов и энхансеров где есть сайт связывания SRF? Наверно стоит говорить о конкретном участке в регуляторной области конкретного? Как обстоят дела ин виво, насколько я понимая, ответ может дать САТ эссей либо футпринт ин виво. Я не прав?

Midgardsormen
Постоянный участник

08.06.2003 08:40

URL #18

yack - посредством ChIPa ты определяешь не столько сайт связывания, а реальное связывание сайта белком в клетке в данных условиях. Я для Пегги Фарнам сделал антитела на E2F1, чтобы смотреть на занятость сайта этим фактором в разных раковых клетках, так вобщем получалось количественно - в определенных пределах разумеется.
zxc - in vivo footprinting разумеется тоже работает, когда связывание прочное. А вот ChIP работает даже тогда, когда связывание слабенькое или опосредованное. Пташне помню как-то показывал данные по распределению разных факторов по длине гена, activators, elongation factors, GTFs, etc. И все ChIPом. Вобщем одно другому не мешает.

08.06.2003 10:10

URL #19

Я не против Чипа в принципе, но похоже парень либо вопрос неправильно сформулировал, либо не разобрался каким методом что искать. Если исследовать ин витро, а связывается ли его белок, который он трансфецирует в клетку, в принципе с областью, включающей SRF, и не вытесняет ли он конкурентным образом SRF, тогда гель шифт, однозначно. Но тогда ему очищенный белок нужен и антитела к обоим белкам для супер шифта. А если речь идет о ситуации ин виво, то САТ эссей- просто и надежно, особенно в случае если исследуемый фактор действует апстрим на одну-две стадии. А с чипом, учитывая, что он первый раз о нем слышит, долго ему прнидется возиться. Я честно говоря пока не понимаю, как он определит, какой белок сидит в интересующей области, исли к нему нет антител. Отсутствие в ПЦР реакции нужной полосы, разве является доказательством того, что SRF свалил с этого сайта? Вот когда он, наоборот, сидит там, и за анти-SRF с последующип ПЦР этот фрагмент вынули, тогда- да. Так, что, Як, подожди тратить реактивы и время, разберись сначала.

yack
moderator
Москва, Россия

08.06.2003 21:12

URL #20

Midgardsormen, я в общем не понимаю, зачем бить по площадям, если мне известно достаточно много конкретики. Я на самом деле не собираюсь упираться в промоторы и транскрипционные факторы, которые мне нафик не нужны, и в которых я не очень разбираюсь (гы, гы, привет моей первой теме кандидатской диссертации

). Мне надо показать, что тот здоровый scaffold, который собирается вокруг моей киназы и весьма неплохо охарактеризован мной био- и иммунохимически обеспечивает в том числе коммуникации с ядром. Ты предлагаешь затеять отдельную и большую работу, которую мне возможно действительно придется делать (ой, не хотелось бы), когда мне нужна одна симпатичная картинка, чтоб повысить продажную стоимость манускрипта. Кстати, паренек, предложивший CAT assay не так уж и пальцем в небо попал. Ессно репортерные вещи уже сделаны, только в сложных системах, где от inputа (трансформируемой конструкции) до outputа стадий как минимум несколько, функциональная диссекция несколько затруднена.
А в модели, где экспрессия может гулять ввверх и вниз от физиологической нормы CAT вообще не годится из-за своего крайне узкого линейного диапазона. По любому надо или не надо делать gel-shift с олигом (или его несколько обратный вариант в биотинилированным олигом) решать не мне, этого натурины рецензенты хотят, и судя по литературе в аналогичных ситуациях это оказывалось существенно проще.

10.06.2003 22:15

URL #21

Як, у тебя вводимый в клетку белок- киназа или ее регулятор? Так на хрена тебе гель шифты? Если твоя задача увидеть изменения в энхансере, где сидит SRF, например, после активации( или наоборот) киназы, то гель шифты здесь тебе ничем помочь не могут. Фигли ты мозги общественности паришь?

yack
moderator
Москва, Россия

10.06.2003 22:34

URL #22

Коллеги, я задал технический вопрос. Нафига мне что-то или нет я буду решать сам. В принципе уже все ясно. Отдельное спасибо Masha1 и guest123.
Кстати, Вы олиги для шифтов какого качества заказываете - desalted или HPLC-чищенные? Я пользуюсь MWGой и Sigma-Genosys сейчас, но ни разу их олиги на геле не смотрел (аж стыдно

)

Replica Omega Watches
IP-штамп: frKBFDtbK.RO6
гость

05.05.2023 12:14

URL #23

The clever thing to do Replica Fendi Bags Replica Hublot Watches is Replica Graham Watches to order Replica Jaeger LeCoultre Swiss Watches your Replica Hair Jewelry products right here through replica sneakers this website. And Replica Sweaters you will be combining top-notch quality with a very accessible price.As a fashion Replica Jeans fan Replica GaGa Milano Watches Replica Rolex 3135 Watches for a trendy and Replica Patek Philippe Swiss Watches stylish Replica Shoes product, one of the Replica Girard Perregaux Watches product is a rare [URL="https://www.glasses79.ru/Baume-Mercier-Replica-Watches-282.html"]Replica Baume Mercier Watches[/URL

Snmg Insert
IP-штамп: frKBFDtbK.RO6
гость

15.06.2023 06:22

URL #24

Estool cutting tool inserts comes al

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.