Сочините "с потолка" несколько вариантов и пробейте по БЛАСТу...
Обязательно один из понравится, и даже окажется лучше чем тот с 3- штрих конца конструкта. Последите чтобы 3-штрих кончик самого праймера не был обогащен ГЦ.

  Спасибо! Этот вариант есть всегда, но хотелось бы все-таки минимизировать риск. Мышь - это, все-таки, не плазмида, так просто не переделаешь, если праймер "с потолка" не сработает...

  если праймеры Вам делают быстро, можете пойти и другим путем - сперва сделать обычную inverse PCR с 4-cutter рестриктазой и отсеквенировать, а после, уже точно зная участок вставки, заказать пару праймеров из прилегающих участков генома и отпцрить.

  Как это не сработает?  
Тогда берите у курицы/ящерицы/рыбы...
Или выкладывайте тот праймер, а охотники-дизайнеры для второго праймера найдутся. Это же молбиол.ру, хлебом не корми...

  Где-то здесь была программа подбора последовательностей, негомологичных определённому геному...

  Дизайн, это конечно круто, но хотелось бы все-таки использовать опробованные in vivo праймеры. Цена ошибки слишком велика - не хочется "переделывать" мышь, если праймер вдруг не сработает...

  Праймы-то делают быстро, но при получении трансгенных мышей часто сразу встраиваются несколько копий конструкта в разных участках генома, что существенно усложнит ситуацию (по хорошему, придется клонировать ПЦР продукты в какой-нибудь вектор и секвенировать отдельные клоны). При этом еще, как правило, анализируют сразу несколько мышей, у которых конструкт встроился (potential colony founders), что умножит работу еще в несколько раз...

  Праймы-то делают быстро, но при получении трансгенных мышей часто сразу встраиваются несколько копий конструкта в разных участках генома, что существенно усложнит ситуацию

  ...В конце конце, моделируйте эксперимент, прежде чем приступать к "переделыванию" своих грызунов. ...

  На трансгенезе съели собаку, предлагаю следующее решение:
Во-первых попробовать все-таки заказать праймеры на 5'-конец существующий и попробовать по-ПЦРить сам вектор, он ведь уже у Вас есть? для моделирования эксперимента провести это все с мышиной ДНК в равных пропорциях, как это могло бы быть в геноме. Вполне возможно, что даже горбатый конструкт заПЦРится
Во-вторых, есть очень важный нюанс: ОЧЕНЬ ЧАСТО концы трансгена объедаются при встраивании, почти всегда теряется как минимум 10-50 нуклеотидов, иногда доходит до пары сотен, а иногда и килобаза отваливается. учтите это обязательно, если соберетесь вводить в 5'-область маркер.
В третьих: вы уверены, что у Вас получится отпцрить весь конструкт нормально и секвенировать его? Во-первых это 4кб, довольно-таки много, во-вторых там 99% будет тандем, и может быть много разных амплификонов, которые отличаются чуть чуть и будет беда на сиквенсе.
Третье: если все-таки решитесь, то можно пользоваться обычными критериями (ГЦ-состав, наличие шпилек и т.д., отсутствие гомологии в геноме мыши) сделайте обычный праймер. Можно сделать чуть более длинным, чем обычно, для уверенности.
Чевтертое: Все-таки подумайте о TAIL-PCR либо об инверс-ПЦР.
Пятое: сделайте сразу несколько конструкций, и включите их в один экспиримент по микроинъекции. Кто колоть будет, если не секрет? Есть люди с высоким уровнем навыков, большой процент мышек трансгенных получают.

  Прошу совета!

Делаю трансгенную мышь. Хочется убедиться, что весь конструкт целиком встроится в геном. Для этого хочу иметь возможность его целиком обратно от-ПЦР-ить и отдать на секвенирование. На 3ь конце конструкта есть праймер с Тм - 60С. А на 5ь конце все грухо - сплошные "репеатс", поэтому праймер не найти. Планирую добавить на 5ь конец конструкта последовательность какого-нибудь праймера, тоже с Тм в диапазоне 60С, с как можно лучшими характеристиками, в первую очередь, чтобы максимально отличался от любых эндогенных последовательностей мышиного генома.

Как подойти к вопросу дизайна этого "суперпраймера"?

Последовательность может быть любая, т.к. я ее добавляю дополнительно, главное - максимальная специфичность получившегося праймера!